פרוטוקול זה מתאר איסוף של נתונים מסיביים ממיקרו-ריי מחייב חלבון-DNA עבור primase, אנזים שנקשר באופן חולף לרצפי DNA ספציפיים בתורו מקטלז היווצרות של פריימרים RNA. וידאו זה יכסה כיצד טכנולוגיית microarray יכול לעזור להגדיר מחדש אתרי זיהוי רצף primase וכיצד גישה תפוקה גבוהה יכולה להחמיא ביוכימיה קלאסית. טכניקה זו משלבת שתי גישות: פרימאז DNA מחייב microarray ובדיקות פעילות primase.
Microarray מספק נתונים מסיביים של primase מחייב רצפי DNA, שם כמו בדיקה ביוכימית מספק מידע על היווצרות פריימר RNA על ידי פרימז DNA. הפעילות האנזימטית שנבדקה תלויה בתובנה מניסוי המיקרו-ריי ותפוקתו הנמוכה יותר באופיו. הקשר בין יעילות הכריכה, בחירת רצף הדנ"א לבין פעילות האנזים נבדק.
זיהוי של קביעת רצף באמצעות microarray, מאפשר לנו להסיק מסקנות מדויקות המבוססות על נתונים מסיביים של microarray. גישה זו שימשה עד כה לתיאור רצפי קשירה DNA של גורמי שעתוק. גורמי שעתוק הם חלבונים סטטיים הנקשרים בחוזקה לדנ"א.
הוכחת ההליך תהיה סטפן איליק. כדי להתחיל בהליך זה, הרטיב מראש את החלקת המיקרו-ריי על-ידי הנחתה בצנצנת קופלין המכילה 0.01%Triton-X 100. ומסתובב על מסובב מעבדה, להוסיף 125 סל"ד במשך חמש דקות.
פיפטה פתרון החסימה לתוך קופסת פלסטיק. ואז להסיר את השקופית microarray מתוך צנצנת coplin. השתמש בניגוב עדין כדי להניע את הצד שאינו DNA ואת הקצוות של השקופית.
מניחים באיטיות את המיקרו-ריי בקופסת הפלסטיק. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה עם רעידות איטיות. לאחר מכן, לשטוף את השקופית פעם אחת עם 0.01%Tween-20 ב- PBS.
על מסובב מעבדה ב 125 סל"ד במשך חמש דקות. הסר את Tween-20 ולשטוף את השקופית פעם אחת עם 0.01% טריטון-X 100 ב- PBS על מסובב מעבדה ב 125 סל"ד במשך שתי דקות. לאחר מכן העבר במהירות את השקופית לצנצנת קופלין המכילה PBS.
תחילה, הרכב את תא PMB כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מקם את השקופית בשטח המיועד לכך. השתמש פינצטה לדחוף אותו למטה ושמאלה.
מניחים את אטם הסיליקון על גבי, לוודא שהוא מיושר היטב עם החלק התחתון של תא PBM. ואז לסגור את התא ולהדק את הברגים באלכסון. פיפטה תערובת חלבון מחייב לתוך כל באר של אטם.
לאחר מכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. כדי להתחיל, פיפטה 0.05%Tween-20 ב PBS לתוך תא PBM לשטוף בקצרה את השקופית. באמצעות שאופרטור ואקום, להסיר את הפתרון מן בארות התא נזהר לא לגעת כתמי DNA.
חזור על זה, לשטוף בקצרה את השקופית עם PBS. ולהשתמש בוואקום כדי להסיר את הפתרון מ בארות התא תוך הקפדה לא לגעת כתמי DNA. לאחר מכן, להוסיף אלקסה 488 מצומד אנטי הנוגדן שלו לכל באר של תא PBM.
דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף בקצרה את השקופית בתוך תא PBM על ידי הוספת כמה טיפות של 0.05%Tween-20 ב PBS לתוך כל באר. ולהשתמש בשואב הוואקום כדי להסיר את הפתרון מ בארות התא, נזהר לא לגעת כתמי DNA.
לפרק את תא PBM ולהסיר את השקופית. שטפו את השקופיות פעמיים ב-0.05%Tween-20 ב-PBS, כאשר כל שטיפה נמשכה שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBS, כאשר כל שטיפה נמשכה שלוש דקות כל אחת.
ופעם אחת במים מזוקקים כפולים במשך שלוש דקות. יבש את השקופיות עם אוויר דחוס. ולאחסן אותם בתיבת שקופיות כהה עד מוכן לסריקה.
כאשר מוכן, להשתמש בסורק microarray כדי לסרוק את השבב עם העירור של 495 ננומטר ו פליטה של 19 ננומטר. ולאסוף את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית. במחקר זה פרופיל פרימז תפוקת פאי משמש למיפוי אתרי כריכת primase, כולל אלה שקשה אם לא בלתי אפשרי להתבונן באמצעות כלים קלאסיים.
חשוב לציין, פרופיל פרימז תפוקת פאי מאפשר בחינה מחדש של ההבנה המסורתית של אתרי כריכת פרימז. במיוחד פרופיל פרימאז תפוקת פאי מגלה ספציפיות מחייבת בנוסף לרצפי זיהוי ידועים של 5'GTC3', מה שמוביל לשינויים בפעילויות הפונקציונליות של T7 DNA primase. כלומר, שתי קבוצות של רצפים מזוהות.
רצפי דנ"א קשירה חזקים שהכילו TG באגפים ורצפי דנ"א מחייבים חלשים שהכילו AG באגפים. לא זוהה איגוד פרימאז לתבניות דנ"א שהיו חסרות 5'GTC3' בתוך הרצפים שלהן. אתרי זיהוי הדנ"א של primase המכילים תכונות ספציפיות כגון אגפים עשירים ב- TG, מגדילים את ה- DNA של primase עד פי 10.
באופן מפתיע, הם גם להגדיל את אורך RNA שזה עתה נוצר. חשוב לציין, פרופיל פרימז תפוקה גבוהה מאפשר לנו להתבונן ולכומת את השונות באורך פריימר ביחס לרצף של תבנית ה- DNA. בעת ביצוע הליך זה שלבי הכביסה צריכים להיות עדינים.
ומאגרים צריכים להכיל רכיבים שרשמתי את הפרימטאז בדנ"א. גם סף של אירועים מחייבים חסרי תועלת נקבע ביוכימית. לכן ניתוח של microarray אינו מספיק.
שיטות כגון תהודה פלזמה פני השטח ובדיקות משמרת ג'ל יכול לקבוע את הזיקה מחייבת של primase כדי לבחור את רצפי ה-DNA. המעבדה שלי מיישמת מודלים לחיזוי למידת מכונה כדי לזהות גורמים לרצף פרימאז המניבים פריימרים פרודוקטיביים שניתן להאריך על ידי פולימראז DNA. בעידן של ביג דאטה, יישום של שיטות סטטיסטיות לניתוח ביג דאטה, הטכניקה בהחלט תעזור לאפיין טוב יותר רצפי דנ"א ספציפיים ולקשר את זיהוי הרצף לפעילות הפרימטיז.
כל מי שעובד עם קרינה צריך הבנה מעמיקה של תקנות ומפגעים הקשורים לשימוש בקרינה מייננת. צריך לעבור הכשרה צריך לעבוד עם ציוד בטיחות.
