הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה יכול לשמש כדי לזהות רצפים גנומיים שלא ניתן לבודד רצפי טיהור שותף, אשר עשויים עצמם להיות ידועים רק חלקית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שזה זול, באמצעות תוכנה חופשית בעיקר כי ניתן להוריד, כמו גם גמיש. אתה יכול ליישם את זה על שאלות ביולוגיות רבות.
יישומים פוטנציאליים כוללים זיהוי מטרות חיסון חיידקי וזיהוי וירוסים שהרצפים שלהם שונים מאוד ממיקרואורגניזמים ידועים. ניתן להחיל שיטה זו על כל מערכת שבה לא ניתן להפריד את הלא נודע באופן ניסיוני, כל עוד רצף הייחוס ללא היעד הגנומי זמין. טכניקה זו לוקחת קצת ניסוי וטעייה, ולכן סבלנות חשובה.
ייתכן שיהיה עליך בעיות לירות בתוכניות. אתה יכול להשתמש בתוכניות שונות מאלה שאנו מתארים כאן. השתמש במדריכים למשתמש ככל האפשר.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שעבודה חישובית תלויה בהבנה בסיסית של אופן המבנה של תיכנות שורת הפקודה. כדי להתחיל, השתמש Trimmomatic 0.32 כדי להסיר מתאמי illumina ובסיסים באיכות נמוכה. השתמש בגירסה אגס 0.9.11 כדי ליצור קריאות ממוזגות באיכות גבוהה מפלט trimmomatic מזווג קריאות באמצעות פרמטרי ברירת המחדל.
לאחר מכן השתמש בגירסה זוחלים 1.1 כדי לתקן את הקרויים המיוצרים באמצעות אגס. לבסוף השתמש ב- Trinity גירסה 2.4.0 במצב ברירת מחדל כדי להרכיב את הרצפים מתוקנים. עבור ספריות ספציפיות לגדילים, השתמש בפרמטר SS_lib_type גדיל.
הפלט הוא קובץ FASTA שימוקם בספריה חדשה הנקראת trinity_output. הפוך מסד נתונים BLAST של רצף ההפניה nucleotide_reference. פאסה בשורת הפקודה.
BLAST התאימה לשאילתה שהורכבה למסד הנתונים של ההפניה. כדי להשיג קובץ פלט, השתמש BLAST_results. txt כדי ליצור פלט טבלאי הנדרש עבור שלבי עיבוד תת-קווינס עם סקריפטים של פייתון, השתמש ב- outfmt 6 להקפצה מוגברת, השתמש ברצפי חלבונים מההרכבה כשאילתת BLAST עם NUCLEOTIDE BLAST מתורגם, המבצע תרגום שישה-לכיוון של מסד הנתונים של הנוקלאוטיד.
כדי להשיג רצפי חלבונים עבור השאילתה, הפעל את TransDecoder. הפקודה Long0rfs כדי לזהות את מסגרות הקריאה הפתוחות הארוכות ביותר מתוך רצפי שאילתות שהורכבו. עכשיו תרוץ תבלסטן.
במידת הצורך, ודא שהקוד הגנטי הנכון נבחר עבור האורגניזם הנחקר באמצעות db_gencode עם אפשרות הקוד המתאימה. אם יש התייחסות לחלבון באיכות גבוהה, השתמשו בהתאמת חלבון-חלבון עם blastp במקום tblastn הפוך מסד נתונים BLAST של התייחסות החלבון. הקפד לשמור את התוצאה כקובץ לעיבוד במורד הזרם, ולהשתמש בפלט טבלאי כדי להבטיח שקבצי ה- Script של פייתון יוכלו לנתח אותם כראוי.
עכשיו, השתמש בסקריפט הפייתון התת-אקטיבי כדי להסיר רצפים תואמים. כדי למפות את ההיקראות על ההרכבה, השתמש BWA-MEM גירסה 0.7.12 או bowtie 2 כדי למפות את קריאות גלם שהורדו על הרכבת השאילתה. תחילה, צור אינדקס להרכבה ולאחר מכן מפה את ההקרנות.
הפלט יהיה בתבנית SAM. הפעל את הסרת קובץ ה- Script של פייתון ללא מיפוי. py באמצעות קובץ SAM כקלט.
פעולה זו מזהה את השמות של רצפי שאילתות ללא קריאות תואמות ושמור אותם בקובץ טקסט חדש. הפלט של השלב הקודם הוא רשימה של שמות רצפים בקובץ txt. חלץ קובץ FASTA עם רצפים אלה.
הפלט יהיה קובץ fasta. השתמשו ב-Genius כדי לקבוע רצפי פריימר אופטימליים באופן ידני. הדגש רצף מועמדים של 21 עד 28 זוגות בסיס עבור פריימר קדימה, הימנעות ריצות של ארבעה או יותר של כל בסיס.
נסו למקד אזור עם שילוב אחיד למדי של כל זוגות הבסיס. G או C יחיד בשלושה פריים אנד מועיל, עוזר לעגן את פריימר. לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה בצד ימין של המסך כדי להציג את טמפרטורת ההיתוך המשוערת של רצף זה כאשר האזור המועמד מסומן.
כוון לטמפרטורת התכה בין 55 ל -60 מעלות צלזיוס, תוך הימנעות מחזרות, ו ריצות ארוכות של G C.Choose פריימר הפוך באותו אופן, ממוקם 150 עד 250 זוגות בסיס שלושה פריים של פריימר קדימה. בעוד אורכי פריימר לא צריך להתאים, טמפרטורת ההיתוך החזוי צריך להיות קרוב ככל האפשר לזה של פריימר קדימה. הקפד להפוך את הרצף על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ב- Genius בזמן שהרצף מסומן באפשרות תפריט.
שיטה חלופית היא להשתמש בפונקציה עיצוב פריימר, שנמצאת בסרגל הכלים העליון בחלון הרצף. הוסף את האזור להגברתו תחת אזור היעד. תחת הכרטיסיה מאפיינים, הוסף את הגודל הרצוי, טמפרטורת ההיתוך ו- G C אחוזים, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור פריימרים.
כדי לבצע אימות PCR כמותי של הרצף הנותר, הכינו תחילה תערובת תגובה עבור כל תבנית ב- triplicate, עם תערובת המאסטר הירוקה של SYBR, פריימרים קדימה ואחפה ומים, לנפח כולל של 25 מיקרוליטרים. הפעל תוכנית qPCR המודיעה על-ידי הטמפרטורה ותזמן ההארכה שהיו מאומתים בעבר. עקומות denaturing הסופי צריך להיווצר לפחות בפעם הראשונה פריימרים מועסקים qPCR כדי לאמת את ההגברה של מוצר DNA יחיד.
למדוד את האותות הירוקים qPCR SYBR יחסית Actin על ידי Ct עבור כל המקרים, לחשב את הממוצע, ואת סטיית התקן של שניים Ct יחסית Actin. בצע אלקטרופורזה של ג'ל נקודת קצה, כדי לאשר זיהוי נכון של גודל המוצר על-ידי qPCR. כאן, להפעיל 25 microlitres של המוצר qPCR מעורבב עם חמישה microlitres של צבע 6X Glitterol על 2%TAE אגרוז ג'ל ב 200 וולט במשך 20 דקות.
אם ה- qPCR שלך מראה שלא זיהית את רצפי היעד, חזור על המחזור כולו עם הפניה חדשה, שעשויה להתקבל ממסד נתונים מקוון. הפרויקט התת-אקטיבי במקרה זה התחיל ברצף ה-RNA מרקמה מרופדת חיידקים של פרוש זברה בוגר זכר ונקבה. בסופו של דבר, זוהו 935 גנים סומטיים שלא נכללו קודם לכן בכל ביאור הגנום.
לאחר סינון חישובי, PCR כמותי עשוי להניב תוצאה שלילית שבה לא היה הבדל בזיהוי על פני רקמות ציפורים. לעומת זאת, תוצאה חיובית המייצגת את הזיהוי של רצף יעד אמיתי מאושרת כאשר DNA גנומי qPCR מראה זיהוי גדול יותר סטטיסטית ברקמת העניין, ביחס להתייחסות. כאן, גן הצמד אלפא אומת להיות מוגבל נבט כי זה היה מדולדל ברקמה סומטית יחסית לדנ"א האשכים שבו היה נוכח כי רמות שוות ערך Actin.
חשוב לזכור להשתמש בקלט הנכון במהלך כל אחד מהצעדים החישוביים. ייתכן שיהיה עליך לעבור את חיסור המחזור מספר פעמים כדי להשיג את רצף היעד או רצפים. מגוון ניתוחים פילוגנטיים, מבניים ותפקודיים יכולים להתבצע על הגנים שהתגלו.
שיטות נוספות אלה מעניקות תובנה לגבי התפקידים האבולוציוניים והתפקודיים של הגנים. זיהינו את הגן הראשון על כרומוזום ציפורי שיר מוגבל נבט, שהרחיב את העניין ביסוד הגנומי המפתיע הזה. העבודה שלאחר מכן הראתה כרומוזומים דומים במין ציפורי שיר רבים המכילים גנים רבים נוספים.
