השיטה הקלאסית שבה חלבוני קרום מופצים למחקר שלהם היא על ידי מינון פשוט בחומר ניקוי. בעוד זה מספק שיטה פשוטה ואוניברסלית, חומרי ניקוי הוכחו לשנות את המבנה המקומי, תפקוד ופעילות של חלבונים רגישים אלה. כאן אנו מציגים את הפפטידיסק כפתרון לייצוב חלבוני קרום בתתרן נטול חומרי ניקוי.
מערכת Peptidisc מסתגלת באופן ספונטני לגודל, לצורה ולטייפולוגיה של שלל חלבוני קרום. זה עומד בניגוד פנטומימה קרום אחרים, כי לעתים קרובות דורשים אופטימיזציה מייגעת. FhuA, חלבון קרום יוצא E.coli, ישמש חלבון יעד מודל להיות מחדש בפרוטוקול זה.
ורי ממברנה החיצוניים יהיו מבודדים ואחריו תוספת של חומר ניקוי כדי לבודד את חלבוני הממברנה. פפטיד Peptidisc מתווסף מיסות וחומר ניקוי מדולל משם, באופן ספונטני להרכיב חלקיקי פפטידיסק. חלקיקים מסיסים מיוצבים אלה נוחים כעת עבור יישומים רבים במורד הזרם.
פרוטוקול זה יבחן אינטרפרומטריה ביו-שכבתית כיישום של טכנולוגיית פפטידיסק. פרוטוקול זה יתמקד בשיטת ההשבה של PeptiQuick, טכניקה שימושית המאפשרת טיהור בו זמנית והתחדשות של חלבוני קרום. שיטת PeptiQuick של התחדשות על חרוזים מבוצעת בעמודת כבידה סטנדרטית של ניקל-NTA IMAC שנדונה מראש בחומר ניקוי.
הממברנה המסויסה נטענת על שרף וחלבונים שאינם מטרה נשטפים. לאחר פפטיד זה מתווסף לעמודה ואת חומר הניקוי מדולל במהירות. הצד ההידרופובי של הפפטיד פפטידיסק מקשר עם האזורים ההידרופוביים החשופים.
הצד ההידרופילי של הפפטיד שומר על החלבון מסיס בתמצית. עודף פפטיד נשטף. אימידזול מתווסף כדי לחמק מהזעם המשוחזר.
הפיגום Peptidisc עשוי להיות פונקציונלי כדי לסמן בעקיפין חלבוני זיכרון ובכך לפתוח את הדלת לקבוצה רחבה יותר של ניתוחים במורד הזרם. כאן אנו מנצלים את פפטיד biotinylated עבור התקשרות חיישנים מצופים סטרפטבידין לניתוח BLI. אינטרפרומטריה ביו-שכבתית היא טכניקה רבת עוצמה ללא תווית לחקירת אינטראקציות ביומולקולריות בתסומה.
בנוסף להדגמת אינטראקציות, טכניקה זו מעניקה קריאה קינטית בזמן אמת ומאפשרת חישוב של קבוע דיסוציאציה מחייב. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבטלים את הצורך בחומר ניקוי במהלך ניתוח BLI, כמו זה יכול לשנות את הפעילות. אינטרפרומטריה של קוטל ביולוגי מנתחת את ההפרעה העוברת של אור לבן המוחזר מהחיישן, או מהטיפ, ומולקולות מאקרו קשורות במהלך אינטראקציה.
כדי למדוד את האינטראקציות, קצה החוש מועבר בין פתרונות לבין האות המוקלט בכל שלב. כל טיפ נותן עקבות משלו על סנסוגרמה. ראשית, נוצרת תוכנית בסיסית של מאגר בלבד.
שנית, הליגנד כבול. במקרה זה, FhuA ופפטידיסקים ביוטינילציה קושר קצה מקודד סטרפטבידין. לאחר מכן, הקצה נשטף במאגר כדי להסיר כל FhuA לא מאוגד.
עכשיו הטיפ מועבר לפתרון עם ריכוז ידוע של אנליט, כאן קולם. אם מתרחשת אינטראקציה, פעולה זו תעניק עקומת איגוד. לבסוף, הקצה מועבר למאגר והדיסוציאציה נמדדת.
ניתן להשתמש בשיעורים שנצפו עבור שיוך ודיסוציאציה בכל ריכוז עמודה כדי לחשב את קבוע הדיסוציאציה. Hexahistidine מתויג FhuA בא לידי ביטוי E-coli זן AW740 במשך 18 שעות בתקשורת אמין. החיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 G של 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
גלולת התא וכתוצאה מכך מושעה מחדש במאגר TSG ולאחר מכן dounced כדי לשבור גושים הסלולר ולהבטיח תותבת יסודית. TMSF מתווסף לתאים המושעים מחדש לריכוז סופי של מילימולר אחד ממש לפני תיזה. תזה התא מושגת על ידי שלושה קטעים דרך microfluidizer ב 15, 000 PSI או עיתונות צרפתית ב 8, 000 PSI.
התאים lysed נאספים צנטריפוגה במהירות נמוכה ב 5, 000 G של במשך 10 דקות בארבע מעלות מבוצעת. על-טבעי מספין המהירות האיטית נטען לתוך רוטור אולטרהצנטריפוגה TI70 וצנטריפוגה ב 200, 000 G של במשך 40 דקות בארבע מעלות כדי גלולה קרום E.coli הגולמי. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, העל-טבעי מושלך וכדור הממברנה הגולמי מושעה מחדש בכמות מינימלית של מאגר TSG.
קרום גולמי הוא dounced כדי להבטיח הומוגניות שלה. ברדפורד Assay מבוצע כדי לבדוק את ריכוז החלבון של קרום גולמי מושעה מחדש. חיץ TSG משמש כדי לדלל את הממברנה הגולמית ל כשלושה מיליגרם למיליליטר לפני מינון.
טריטון X-100 מתווסף קרום גולמי מושעה מחדש בריכוז סופי של 1% כדי לבודד באופן סלקטיבי את הממברנה הפנימית חיידקי. מבודד מבוצע במשך שעה אחת בארבע מעלות, עם נדנדה עדינה. הממברנה החיצונית הלא מבודדת מבודדת על ידי אולטרהצנטריפוגה ב 200, 000 G של במשך 40 דקות, בארבע מעלות.
העל-טבעי שנוצר המכיל את הממברנה הפנימית המבודדת מושלך. בעוד גלולה, המכיל את הממברנה החיצונית, מושעה מחדש כמו קודם ב TSG. LDAO מתווסף לריכוז סופי של 1% לממברנה החיצונית המושעית מחדש, ומתבודד למשך שעה בארבע מעלות.
לבסוף, ultracentrifugation מבוצעת, כמו קודם, כדי גלולה חומר מסיס. העל-טבעי שנוצר מכיל קרום חוץ מנוצל, כולל המטרה שלנו, FhuA המתויג שלו, מוכן כעת לטיהור IMAC בו זמנית ופיצוי פפטידיסק. עמודת כבידה IMAC ניקל-NTA הוא שיווי משקל מראש עם שני כרכים טורים של מאגר לשטוף IMAC.
Imidazole מתווסף בריכוז סופי של חמישה מילימולר לממברנה החיצונית המבודדת, מדולל ל 0.04% LDAO. הממברנה החיצונית המבודדת נטענת על שרף ניקל-נת"ע, והזרימה דרך נאסף. זרימה זו דרך נטענת מחדש על רשף כדי להגדיל את איגוד שף של FhuA.
לאחר הטעינה, השרף נשטף עם 250 מיליליטר של חיץ שטיפת IMAC ואת 50 המיליליטרים הראשונים שנאספו. לאחר הכביסה, חיץ הכביסה מנוקז ממש מעל לגובה מיטת שהף והעמוד נסגר. מיליליטר אחד של מרוכז, 10 מיליגרם למיליליטר, פפטיד פפטידיסק מתווסף לעמודה.
בעקבות תוספת של פפטיד מרוכז, 50 מיליליטר של לדלל, מיליגרם אחד למיליליטר, פפטיד פפטידיסק ב TSG מתווסף. השף הוא עורר מחדש להשעות את החרוזים לתוך TSG, מתחת CMC של LDAO, ובכך יוצרים חלקיקי פפטידיסק. בעקבות לכידת פפטידיסק, ניתן להתיישב עם שהרשת ופתרון הפפטיד של מיליגרם אחד למיליליטר מתרוקן דרך רשף.
השף נשטף עם 50 מיליליטר TSG כדי להסיר עודף פפטידיסק פפטיד. לבסוף, חלקיקי פפטידיסק מדוללים עם 50 מיליליטר של 600 מילימולרים imidazole ב TSG. שברים מיליליטר אחד נאספים ו 10 microliters של 0.5 EDTA טוחן מתווסף, אור מפתח יצוק ניקל ions.
ההתחלה, הזרימה דרך, לשטוף, שברים חמק נטענים על 12% ג'ל SDS ואלקטרופורז במשך 30 דקות ב 60 מיליאמפר. הג'ל מוכתם ומדמיין בסורק ג'ל. הג'ל שנוצר מראה דלדול של FhuA בזרימה דרך, והעשרה באלוטיון.
להקות מזהמות קלות נצפו גם בשברים שחמקו. שברים 3 עד 7 נבחרים עבור כרומטוגרפיה אי הכללת גודל כדי לאשר מסולביליות FhuA Peptidisc ולרוקן מזהמים. 30 קילודום מנותק צנטריפוגלי concentrator משמש לריכוז שברים שלוש עד שבע.
מיליליטר אחד של שברי התחמקות IMAC במאגר מוזרק אל העמודה S200 בקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה במאגר TSG. שברים מיליליטר אחד נאספים וג'ל SDS 12% של שברים הוא רץ. השברים הרלוונטיים מאגרים וייתכן שישתמש כעת ביישומים במורד הזרם.
BLI נערך ב פורטביו אוקטנט RED96. מכשיר זה מזיז סיכות BLI על פני צלחת 96 באר אשר מוגדר לראשונה ביד. כל בארות מלאים לנפח סופי של 200 microliters.
עמודה 1 עמוסה במאגר קינטיקה כדי לאפשר לטיפים לצייד וצור אות בסיסי. עמודה 2 נטענת עם ריכוז שנקבע מראש של מאגר הליגנד והקינטיקה. במקרה זה, FhuA הוא ליגנד, והוא הוסיף ריכוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר.
הטיפ בשורה E ישמש כהפניה, והוא נטען עם מאגר בלבד. עמודה 3 עמוסה במאגר קינטיקה כדי לשטוף עודפי FhuA מהטיפ. דילול סדרתי כפול של האנליט, במקרה זה ColM, נטען מלמעלה למטה בעמודה ארבע.
הגבוה ביותר של ריכוזים אלה משמש עבור שורת הייחוס, כדי למדוד עבור כריכה לא ספציפית של analyte לקצה. עמודה חמש נטענת במאגר. כאן, הקולם יתנתק, והדיסוציאציה נמדדה.
לאחר שהצלחת מוכנה, מגש קצה החיישן והצלחת המוכנה נטענים לתוך מכשיר ה- BLI. תוכנת רכישת הנתונים BLI נפתחת וניסוי קינטי חדש מתחיל. הכרטיסיה הגדרת לוח משמשת להכנסת הפריסה של לוחית 96 באר לתוך התוכנה.
כאן הליגנד FhuA הוא קלט כעומס בעוד ColM analyte הוא קלט כמו המדגם. הכרטיסיה הגדרת Assay משמשת להגדרת משך הזמן ומהירות הסיבוב של הלוח עבור כל שלב בניסוי. כאן אנו כוללים שלב בסיסי של 60 שניות, ואחריו שלב טעינה של 250 שניות, שלב בסיסי שני של 300 שניות, שלב שיוך אנלייט של 450 שניות, ולבסוף שלב דיסוציאציה של 900 שניות.
שלבים אלה מוקצים בנפרד לכל עמודה בצלחת של 96 הבאר על-ידי בחירת השלב הרצוי ולחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על האפשרות הוסף הצגה בכל עמודה. לשונית הקצאת החיישן משמשת כדי להבטיח שמכשיר השמינייה לוקח סיכות BLI ממיקומם הנכון במגש החיישן. הכרטיסיה סקירת ניסוי מספקת סקירה סופית של הניסוי, לפני ביצוע הניסוי.
BLI יבוצע כעת על ידי האוקט אדום. פעולה זו תפיק סנסוגרמת נתונים גולמית לניתוח. הניתוח מבוצע על ידי פתיחה ראשונה של תוכנת ניתוח הביו-נתונים של שמינית.
הכרטיסיה בחירת נתונים משמשת לאיתור הניסוי ולבדיקה של הסיכום הניסיוני. הריכוזים של האנליט קולם הם קלט כאן. לאחר מכן, הכרטיסיה עיבוד משמשת לחסרת אות ההפניה מהנתונים הניסיוניים.
תוכנית הבסיס מוגדרת ליישור ציר ה- Y כאילו הוחל קצב ביטול סגסוגת שלו. לבסוף, נבחרה נתוני תהליך. הנתונים מבודדים עבור ניסוי זה, ו-Fit Curves נבחר.
נבחרה התאמה חלקית של עקומת שיוך ודיסוציאציה. Kd מחושב מתוך התאמה זו. כרומטוגרמת אי-הכללת הגודל משמשת לאימות ההשבתה מחדש של ה- ambute.
הכרומטוגרמה מראה שיא סימטרי יחיד, מה שמרמז על הכנת חלבון מונודיספרס. הפסגה זורחת כמה מיליליטרים לאחר נפח החלל, מה שמצביע על חלקיקי פפטידיסק מסיסים שאינם מצטברים. אגרגטים חלבון יהיה לחמק בנפח החלל, בעוד דטרגנטים עודף פפטיד יהיה לחמק בעקבות השיא הראשי.
שטיפה מוגברת של הפפטידיסקים שנוצרו בעודם מחוברים ל-Nickel-NTA חרוזים צריכה לרוקן את הפסגה האחרונה. אגרגטים של חלבונים הם לעתים קרובות תוצאה של חשיפת חלבוני זיכרון לפתרון נטול חומרי ניקוי לפני התחדשות. כרומטוגרמת אי-הכללה אחרונה זו היא אבחון שימושי לפתרון בעיות בהשבתה.
לאחר עיבוד הנתונים הניסיוניים, עקומה מתאימה לסנסוגרמה. הדיוק של התאמה זו חיוני לחישוב קבוע הדיסוציאציה. עלילת התצוגה השיורית מתארת את ההבדל בין הנתונים הניסיוניים לבין ההתאמה החישובית.
זה מראה כי עבור ארבעת ריכוזי העמודות השונים שלושה מהעיקולים מתאימים היטב. עם זאת, עבור הריכוז הגבוה ביותר העקומה אינה מייצרת התאמה טובה. זה מרמז כי בריכוז גבוה יותר זה, יש כריכה הטרוגנית של עמודה לסיכה.
לפיכך, אות הריכוז הגבוה ביותר אינו נכלל בניתוח הקינטי לפי הערות היישום ForteBio. שלוש העקומות הנותרות משמשות לניתוח הקינטי. קבוע דיסוציאציה בין FhuA ו- ColM, שנקבע בשיטת BLI ו- Peptidisc, עולה בקנה אחד עם קבועים שנקבעו על ידי שיטות אחרות.
קלורימטריה ותנו-דיסקים מישוריים, ותרמופורזיס מיקרוסקאלי ופפטידיסק הניבו קבועי דיסוציאציה לא שונים באופן משמעותי מהערך הנחוש שלנו. עקביות זו מאמתת את שיטת Peptidisc BLI למדידת קינטיקה של אינטראקציה. בסדר, אז, לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים כי יש לך צבר הבנה מעשית של כוח ואזהרה של שיטות PeptiQuick.
מצאנו שיטה זו שימושית במיוחד לכמות את האינטראקציה FhuA קולם בהיעדר מוחלט של חומרי ניקוי. ואנחנו חושדים שניתן ליישם את אותה זרימת עבודה כדי לאפיין כל אינטראקציה אחרת בין קולטן לליגנד. בהצלחה עם הניסויים שלך.
