الطريقة الكلاسيكية التي يتم استخراج البروتينات الغشاء لدراستهم هي عن طريق solubilization بسيطة في المنظفات. في حين أن هذا يوفر طريقة بسيطة وعالمية ، فقد ثبت أن المنظفات تغير الهيكل الأصلي ، وظيفة ونشاط هذه البروتينات الحساسة. هنا نقدم Peptidisc كحل لتثبيت البروتينات الغشاء في محلول خال من المنظفات.
يتكيف نظام Peptidisc تلقائيًا مع حجم وشكل وطبولوجيا بروتينات الأغشية التي لا تعد ولا تحصى. هذا يقف على النقيض من المحاكاة الغشاء الأخرى التي تتطلب في كثير من الأحيان التحسين مملة. سوف يتم استخدام FHUA، وهو بروتين غشاء إشريلي خارجي، كبروتين مستهدف نموذجي يتم إعادة تشكيله في هذا البروتوكول.
سيتم عزل حويصلات الغشاء الخارجي تليها إضافة منظف ل solubilize البروتينات الغشاء. يتم إضافة الببتيد الببتيدي إلى solubilization ويتم تخفيف المنظفات بعيدا، وتشكيل تلقائيا جزيئات الببتيديسك. هذه الجزيئات القابلة للذوبان استقرت الآن قابلة للتطبيقات المصب العديدة.
وسيدرس هذا البروتوكول قياس التداخل في الطبقة الأحيائية كتطبيق لتكنولوجيا الببتديسك. سيركز هذا البروتوكول على طريقة إعادة تشكيل PeptiQuick، وهي تقنية مفيدة تسهل تنقية وإعادة تكوين غشاء البروتينات في وقت واحد. يتم تنفيذ طريقة PeptiQuick لإعادة تشكيل على الخرز في عمود الجاذبية IMAC النيكل NTA القياسية قبل توازنها في المنظفات.
يتم تحميل الغشاء سولوبيلد على الراتنج ويتم غسلها البروتينات غير المستهدفة. بعد إضافة هذا الببتيد إلى العمود ويتم تخفيف المنظفات بسرعة. الجانب الهدّاب من الببتيد الببتيزك يرتبط بالمناطق المكشوفة من الماء.
الجانب المائي من الببتيد يحافظ على البروتين القابل للذوبان في المحلول. الببتيد الزائد يُغسل. يتم إضافة إيميدازول إلى غضب إعادة تشكيلها.
قد تكون وظيفية سقالة Peptidisc لتسمية غير مباشرة بروتينات الذاكرة وبالتالي فتح الباب أمام مجموعة أوسع من تحليلات المصب. هنا نستغل الببتيد الحيوي للتعلق بأجهزة الاستشعار المغلفة بالـ streptavidin لتحليل BLI. قياس التداخل في الطبقة الحيوية هو تقنية قوية خالية من التسميات للتحقيق في التفاعلات الجزيئية الحيوية في الحل.
بالإضافة إلى إظهار التفاعلات ببساطة، تعطي هذه التقنية قراءات حركية في الوقت الحقيقي وتمكن من حساب ثابت الانفصال الملزم. من خلال هذا البروتوكول ، نلغي الحاجة إلى المنظفات أثناء تحليل BLI ، لأن هذا يمكن أن يغير النشاط. تحليل التداخل البيولوجي يحلل انتقال انتقال الضوء الأبيض المنعك من المستشعر، أو التلميح، وجزيئات الماكرو المقيدة أثناء التفاعل.
لقياس التفاعلات، يتم تمرير تلميح الإحساس بين الحلول والإشارة المسجلة في كل خطوة. كل طرف ثم يعطي أثرها الخاص على sensogram. أولاً، يتم تأسيس أساس المخزن المؤقت فقط.
ثانياً، الليغاند مرتبط. في هذه الحالة، FhuA وpetidiscs biotinylated يربط تلميح streptavidin منفوش. بعد ذلك، يتم غسل التلميح في المخزن المؤقت لإزالة أي FhuA غير منضم.
الآن يتم نقل تلميح إلى حل مع تركيز المعروفة من التحليلات، هنا ColM. في حالة حدوث تفاعل، هذا سيعطي منحنى ربط. وأخيرا، يتم نقل طرف في العازلة والتفكك تقاس.
يمكن استخدام المعدلات الملاحظة للارتباط والتفكك عند كل تركيز عمود لحساب ثابت الانفصام. يتم التعبير عن الهيكساهيستيدين الموسومة FhuA في سلالة E-القولونية AW740 لمدة 18 ساعة في وسائل الإعلام أمين. يتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 5،000 G 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
يتم إعادة تعليق بيليه الخلية الناتجة في المخزن المؤقت TSG ومن ثم dounced لتفريق كتل الخلوية وضمان تحلل شامل. يضاف TMSF إلى الخلايا التي أعيد تعليقها إلى تركيز نهائي من ملليمتر واحد فقط قبل تحلل. ويتحقق تحلل الخلية من خلال ثلاثة ممرات إما من خلال microfluidizer في 15، 000 PSI أو الصحافة الفرنسية في 8،000 PSI.
يتم جمع الخلايا المهدرجة ويتم تنفيذ الطرد المركزي منخفض السرعة عند 5,000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات. يتم تحميل افرا من دوران بطيئة السرعة في دوار TI70 الطرد المتطرف وطاردة في 200، 000 G لمدة 40 دقيقة في أربع درجات لبيد الغشاء القولونية الخام. بعد الطرد فائقة التركيز، يتم التخلص من المابير و غشاء بيليه الخام هو إعادة تعليق في كمية ضئيلة من المخزن المؤقت TSG.
يتم dounced غشاء الخام لضمان تجانسه. يتم إجراء فحص برادفورد للتحقق من تركيز البروتين للغشاء الخام الذي أعيد تعليقه. يستخدم المخزن المؤقت TSG لتمييع الغشاء الخام إلى ما يقرب من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر قبل solubilization.
يتم إضافة تريتون X-100 إلى الغشاء الخام إعادة تعليق في تركيز نهائي من 1٪ ل سولوبيبليز انتقائي الغشاء الداخلي البكتيري. يتم تنفيذ Solubilization لمدة ساعة واحدة في أربع درجات، مع هزاز لطيف. يتم عزل الغشاء الخارجي غير المنمق عن طريق الطرد فائق التركيز عند 200، 000 G لمدة 40 دقيقة، في أربع درجات.
يتم التخلص من المابير الناتجة التي تحتوي على الغشاء الداخلي المُنمق. في حين أن بيليه، التي تحتوي على الغشاء الخارجي، هو إعادة تعليق كما كان من قبل في TSG. يضاف LDAO إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ إلى الغشاء الخارجي الذي تم تعليقه ، ويتم تجميله لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات.
وأخيرا، يتم تنفيذ طرد فائقة، كما كان من قبل، إلى بيليه المواد غير قابلة للذوبان. يحتوي المابير الناتج عن ذلك على غشاء خارجي مُنمق ، بما في ذلك هدفنا ، FhuA الموسوم له ، وهو جاهز الآن لتنقية IMAC وإعادة تشكيل Peptidisc. يتم توازن عمود جاذبية IMAC من النيكل NTA مسبقًا مع مجلدين من وحدات التخزين غسيل IMAC.
يتم إضافة إيميدازول بتركيز نهائي من خمسة ملليمولار إلى الغشاء الخارجي سولوبيلي، مخففة إلى 0.04٪ LDAO. يتم تحميل الغشاء الخارجي solubilized على راتنج النيكل NTA، وتدفق من خلال جمعها. يتم إعادة تحميل هذا التدفق من خلال على الراتنج لزيادة ربط راتنج FhuA.
بعد التحميل، يتم غسل الراتنج مع 250 ملليلتر من عازل غسل IMAC وأول 50 ملليلتر التي تم جمعها. بعد الغسيل ، يتم تصريف مخزن الغسيل إلى أعلى فقط من ارتفاع سرير الراتنج وأغلق العمود stopcock. يتم إضافة ملليلتر واحد من تتركز، 10 مليغرام لكل ملليلتر، الببتيد الببتيدي إلى العمود.
بعد إضافة الببتيد المركز، 50 ملليلتر من التخفيف، واحد ملليغرام لكل ملليلتر، الببتيد الببتيدي في TSG يضاف. يحرك الراتنج لإعادة تعليق الخرز في TSG، تحت CMC من LDAO، وبالتالي تشكيل جزيئات Peptidisc. بعد الزخارف Peptidisc، ويسمح للراتنج لتسوية ويتم استنزاف واحد مليغرام لكل ميل الببتيد الملي من خلال الراتنج.
يتم غسل الراتنج مع 50 ملليلتر TSG لإزالة الببتيد الببتيديس الزائد. وأخيراً، يتم تخفيف جزيئات الببتيش مع 50 ملليلتر من إيميدازول 600 ملليمولار في TSG. يتم جمع كسور ملليلتر واحدة وإضافة 10 ميكرولترات من 0.5 EDTA 0.5 edta الزرس، وهو أحد الأيونات النيكل الخفيفة الرئيسية المرشّبة.
يتم تحميل البداية ، وتدفق من خلال ، وغسل ، وتهرب الكسور على هلام 12 ٪ SDS وكهرباء لمدة 30 دقيقة في 60 مللي amp. الجل ملطخة ومتخيلة على ماسح هلام. يظهر الهلام الناتج استنفاد FhuA في التدفق من خلال، والإثراء في elution.
كما لوحظت نطاقات ملوثات طفيفة في الكسور المراوغة. يتم اختيار الكسور من ثلاثة إلى سبعة لوني استبعاد الحجم لتأكيد ذوبان FhuA Peptidisc ونضوب الملوثات. ويستخدم 30 كيلودوم قطع المكثف الطرد المركزي لتركيز الكسور من ثلاثة إلى سبعة.
يتم حقن ملليلتر واحد من كسور التلميحات المجمعة من IMAC في عمود S200 بمعدل تدفق قدره 0.25 ملليلتر في الدقيقة في المخزن المؤقت لـ TSG. يتم جمع كسور ملليلتر واحد ويتم تشغيل هلام SDS 12٪ من الكسور. يتم تجميع الكسور ذات الصلة ويمكن الآن أن تستخدم في التطبيقات المتلقين للمعلومات.
أجريت BLI في FORTEBio ثماني RED96. هذا الصك يتحرك دبابيس BLI عبر لوحة 96 جيدا الذي تم إعداده لأول مرة باليد. يتم تعبئة جميع الآبار إلى حجم النهائي من 200 ميكرولترات.
العمود الأول محمل بمخزن حركي للسماح للنصائح بالتكدير وتشكيل إشارة خط الأساس. يتم تحميل العمود الثاني مع تركيز محدد مسبقا من العازلة يغاند والحركية. في هذه الحالة، FhuA هو يغاند، ويضاف إلى تركيز 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.
سيتم استخدام الطرف في الصف E كمرجع، ويتم تحميله بالمخزن المؤقت فقط. يتم تحميل العمود الثالث مع المخزن المؤقت الحركية لغسل FhuA الزائدة من الطرف. يتم تحميل مضاعفة مزدوجة التسلسلي من التحليلات، في هذه الحالة ColM، من أعلى إلى أسفل في العمود الرابع.
وتستخدم أعلى هذه التركيزات للصف المرجعي، لقياس الربط غير المحدد من التحليل إلى طرف. العمود الخامس محمل بالمخزن المؤقت. هنا، سوف تتفكك العقيدة، والتفكك يقاس.
بمجرد إعداد اللوحة، يتم تحميل صينية تلميح المستشعر واللوحة المعدة في أداة BLI. يتم فتح برنامج الحصول على البيانات BLI وبدأت تجربة حركية جديدة. يتم استخدام علامة التبويب "تعريف لوحة" لإدخال تخطيط لوحة 96-well في البرنامج.
هنا في FhuA liga هو الإدخال والحمولة بينما التحليل ColM هو الإدخال كما عينة. يتم استخدام علامة التبويب تعريف Assay لتحديد طول الوقت وسرعة دوران اللوحة لكل خطوة في التجربة. هنا نشمل خطوة خط الأساس من 60 ثانية، تليها خطوة تحميل 250 ثانية، وخطوة خط الأساس الثانية من 300 ثانية، وخطوة اقتران التحليلات من 450 ثانية، وأخيرا خطوة فصل من 900 ثانية.
يتم تعيين هذه الخطوات بشكل فردي لكل عمود في لوحة 96-جيدا عن طريق تحديد الخطوة المطلوبة والنقر بزر الماوس الأيمن على إضافة مُتَصَلّم على كل عمود. يتم استخدام علامة التبويب تعيين المستشعر للتأكد من أن أداة ثمانيت تأخذ دبابيس BLI من موقعها الصحيح في علبة المستشعر. توفر علامة التبويب مراجعة التجربة نظرة عامة نهائية على التجربة، قبل تنفيذها.
سيتم الآن تنفيذ BLI من قبل RED ثمانيت. وستنتج عن ذلك صورة بيانات أولية من أجل تحليلها. يتم إجراء التحليل عن طريق فتح أولا برنامج تحليل البيانات الحيوية ثمانيه.
يتم استخدام علامة التبويب تحديد البيانات لتحديد موقع التجربة والتحقق من الملخص التجريبي. تركيزات التحليل ColM هي الإدخال هنا. بعد ذلك، يتم استخدام علامة التبويب معالجة لطرح الإشارة المرجعية من البيانات التجريبية.
يتم تعريف خط الأساس لمحاذاة المحور Y كما لو تم تطبيق معدل إزالة السبائك. وأخيراً، يتم تحديد "بيانات العملية". يتم عزل البيانات لهذه التجربة، ويتم تحديد Fit Curves.
يتم اختيار اقتران جزئية وتركيب منحنى الانفصام. يتم حساب KD من هذا المناسب. يتم استخدام الكروماتوغرام استبعاد الحجم للتحقق من صحة إعادة تشكيل ambute.
يُظهر الكروماتوغرام ذروة واحدة متناظرة، مما يشير إلى إعداد بروتين أحادي الصوت. ذروة elutes عدة ملليلتر بعد حجم الفراغ، مما يدل على جزيئات بيبديسك غير مجمعة قابلة للذوبان. سوف المجاميع البروتين تتر في حجم الفراغ، في حين أن المنظفات الزائدة والببتيد سوف تتر بعد الذروة الرئيسية.
زيادة غسل Peptidiscs شكلت في حين لا تزال تعلق على حبات النيكل NTA ينبغي أن تستنفد هذه الذروة الأخيرة. المجاميع البروتين غالبا ما تكون نتيجة لتعرض بروتينات الذاكرة لمحلول المنظفات الحرة قبل إعادة تشكيل. هذا آخر استبعاد الكروماتوجرام هو تشخيص مفيدة لاستكشاف إعادة تشكيل واحد.
بعد معالجة البيانات التجريبية، منحنى يصلح ل sensogram. دقة هذا التركيب ضروري لحساب ثابت الانفصام. ويصف مخطط العرض المتبقي الفرق بين البيانات التجريبية والتركيب الحسابي.
وهذا يدل على أن لتركيزات العمود الأربعة المختلفة ثلاثة من المنحنيات تناسب جيدا. ومع ذلك، للحصول على أعلى تركيز المنحنى لا تنتج مناسباً. وهذا يشير إلى أنه في هذا التركيز الأعلى، هناك ربط غير متجانس من العمود إلى الدبوس.
ولذلك فإن هذه الإشارة أعلى تركيز لا تدرج من التحليل الحركي وفقا لملاحظات التطبيق ForteBio. وتستخدم المنحنيات الثلاثة المتبقية للتحليل الحركي. ثابت الانفصام بين FhuA و ColM، يحدد باستخدام أسلوب BLI و Peptidisc، يتسق مع الثوابت التي تحددها أساليب أخرى.
اثمر قياس التحلل الحراري والتوحيدي، والحرارة الدقيقة وPetidisc ثوابت الانفصام التي لا تختلف كثيرا عن قيمة تحديدنا. هذا الاتساق يؤكد صحة طريقة Peptidisc BLI لقياس حركية التفاعل. حسناً، لذلك، بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهمًا عمليًا لقوة وتحذير أساليب PeptiQuick.
لقد وجدنا هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتحديد حجم التفاعل FhuA ColM في الغياب الكامل للمنظفات. ونحن نشك في أن نفس سير العمل يمكن تطبيقها لتوصيف أي تفاعل مستقبلات يغاند أخرى. حظا سعيدا مع تجاربك.
