פרוטוקול זה מדגים באופן חזותי כיצד להקים מערכת תרבות ארוכת טווח ואמינה עבור הטוניקה הפלגית הימית Oikopleura dioica. מערכת התרבות Oikopleura מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של תחומים ביולוגיים הקשורים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה ואבולוציה. למין זה יש מחזור חיים קצר, פליות גבוהה, ו ניתן לאסוף אותו בקלות מהחוף, מה שהופך אותו לאורגניזם מודל מעולה.
למרות פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור O.dioica, אנו מקווים שזה יכול להיות מיושם על אורגניזמים פלנקטוניים אחרים. כדי להתחיל, ליזום מזון אצות כדי לקיים את תרבות Oikopleura, החל autoclaving מי ים מסוננים. כדי ליזום תרבות מלאי של calcitrans Chaetoceros, 60 מילס של מי ים autoclaved היה בתוספת הבאים:30 microliters של ויטמינים, 30 microliters של פתרון A, 15 microliters של נתרן סיליקט, ו 60 microliters של סטרפטומיצין.
לבסוף, 30 מיקרוליטרים של C.calcitrans מתרבות מניות קודמת נוספו כחוסנים. עיין בטבלה השנייה בכתב היד לגבי כרכים של תוספים וחיסון עבור מינים אחרים של אצות וסוגי תרבות. לאחר החיסון, המניות ותת-התת-תתיים נשמרים באינקובטור ב-17 מעלות צלזיוס עם תאורה רציפה.
לאחר כ 10 ימים, צמיחת אצות מאושר על ידי flasks להיות צבעוני. כאשר זה קורה, להעביר את תרבות המניות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס עד חודש תוך שמירה על תת התרבות באותו אינקובטור. כדי ליצור תרבות עבודה, להוסיף תוספי מזון הדרושים 400 מיל של מי ים autoclaved לחסן עם 100 mils של תת התרבות הקודמת.
לאטום את הבקבוק עם כובע גומי, להכניס אחד מיליון, פיפטה חד פעמית, ולהעביר אותם לתחנת אצות ולשמור אותם בטמפרטורת החדר עם photoperiod שמונה שעות ו aeration מתמיד. באופן ידני מערבולת תרבויות אצות פעמיים ביום כדי למנוע צבירה בתחתית הבקבוק. לאחר הקמת תרבויות האצות, לאסוף דגימות שדה באתר מקומי.
השליכו רשת פלנקטון, ואפשרו לקצה בקלה לשקוע מטר עד שני מטרים מתחת לפני השטח. לירות את הרשת במהירות של כ 5 עד 1 מטרים לשנייה. ממשיכים להתריע הלוך ושוב בין שתיים לחמש דקות.
זמן הגרירה צריך להיות מותאם על פי שפע פלנקטון באתר. לאחר ההתרנגות, יש להרים בזהירות את הרשת ולהעביר באיטיות את תכולת קצה בקלה לבקבוק זכוכית של 500 מ"מ. ממלאים את הבקבוק בשוליים כדי למנוע בועות אוויר שיכולות לגרום ללחץ על בעלי החיים במהלך ההובלה.
בשלב זה, נוכחותו של Oikopleura ניתן לאשר על ידי צפייה בקבוקי מדגם על רקע כהה. עם זאת, נדרשת תצפית מיקרוסקופית לזיהוי ברמת המינים. חזור על תהליך זה עד שלושה בקבוקים 500-mil נאספו.
לאסוף מי ים פני השטח כדי לתעד מליחות, טמפרטורה, וריכוז כלורופיל עם profiler CTD. בנוסף, לאסוף 10 עד 15 ליטר של מי ים באתר כדי לעזור להתאקלם בעלי החיים לתנאי מעבדה. כדי להתאקלם בבעלי החיים, הכינו יחס של אחד לאחד של מי ים עיליים מאתר הדגימה ומי ים מסוננים המתוחזקים במעבדה.
הנפח הסופי צריך להיות מותאם בין חמישה ל 10 ליטר, בהתאם לריכוז של מדגם פלנקטון. הוסיפו בזהירות את דגימת ה-500 מ"מ לסק המוכן. באמצעות משוט המחובר למנוע סינכרוני המסתובב ב-15 סל"ד, השאר את פלנקטון בהשעיה למשך הלילה.
למחרת בבוקר, לבדוק את נוכחותו של Oikopleura בעין. מעבירים את בעלי החיים לצלחת פטרי, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ שדה כהה שנקבע בין הגדלה 20 עד 40 פעמים לזיהוי חיובי. Oikopleura מאופיינים כחיות בצורת ראשן המחשוף את זנבותיהם בתוך בית שקוף.
כדי לאשר O.dioica, לחפש זכרים בוגרים לחלוטין עם גונאדים צהובים או נקבות עם ביצים. אם החיות לא בשלות, חפשו נוכחות של שני תאים תת-סדריים בחצי הדיסטלי של הזנב. אלה קיימים הן בבעלי חיים בוגרים והן בבעלי חיים לא בוגרים.
ברגע שהמין מאושר, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה. חזור על תהליך זה עד 10 עד 20 אנשים אושרו ברמת המינים. אם לא נמצא O.dioica, לשמור על המקה ערבוב במשך יום או יומיים נוספים.
O.dioica קטן שלא היו ניתנים לצפייה בתחילה ימשיך לגדול ולהיות קל יותר לראות. אם אף אחד מהם אינו מופיע לאחר שבוע, בטל את הדגימה ונסה שוב לדגום. על מנת להקים מונוקולטורה, לבודד 120 O.dioica מדגם שדה בחמישה ליטרים של מי ים מסוננים.
למחרת בבוקר, חפש זכרים בוגרים לחלוטין שזוהו על ידי גונאדים צהובים ולנקבות עם ביצים המופיעות כעולמות זהובים מנצנצים. הכן מקור להשריץ על ידי העברה עדין של 15 זכרים ו -30 נקבות עם פיפטה 5 מ"מ, קהה סוף למזימה המכילה 2.5 ליטר מי ים מסוננים. כדי למזער את הלחץ הפיזי במהלך ההעברה הידנית, שחררו באיטיות את בעלי החיים מתחת לפני השטח של מי הים החדשים.
אפשר למבוגרים מבודדים להשריץ באופן טבעי. לאחר ההשרצתה, הפריה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי חילוץ חמישה עד 10 מיל של מי ים מתחתית הקוסם להשריץ וזיהוי ביצים עם מחשוף תחת מיקרוסקופ. בבוקר הראשון לאחר ההשרתה, היום הראשון, דור חדש של בעלי חיים צעירים עם בתים מנופחים צריך להופיע במזווה.
השתמש ב-500 מ"ל, כף יד, כדי להעביר בעדינות בעלי חיים לסק חדש המכיל 7.5 ליטר מי ים טריים ומסוננים. יוצקים לאט את התוכן על פני השטח כדי למזער את המערבולות ולהסיר כוחות. בבוקר השני לאחר ההשרצות, היום השני, להעביר באופן ידני 150 בעלי חיים למזווה חדש המכיל חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים.
בבוקר השלישי שלאחר ההשרצות, היום השלישי, מעבירים ידנית 120 בעלי חיים למזנון חדש עם חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים. עד היום הרביעי, בוגר מינית, בעלי חיים בוגרים צריכים להיות נוכחים. לאסוף 15 זכרים ו 30 נקבות עבור מקור הוליד חדש עם 2.5 ליטרים של מי ים מסוננים ליזום את הדור הבא.
תהליך זה חוזר ומתוחזק על חיי התרבות. על מנת לשמור על מונוקולטורה של O.dioica, מזון אצות מוכן מדי יום מתרבויות עבודה. בעלי החיים ניזונים שלוש פעמים ביום.
הכן מזון יומי על ידי מדידת ספיגת תרבות העבודה באמצעות ספקטרופוטומטר שנקבע על 660 ננומטר. ערכי ספיגה, נפחי תרבות O.dioica היעד, ובגרות בעלי חיים ממוקמים לתוך גיליון אלקטרוני מוכן המבוסס על עקומת צמיחה אצות שנקבעו בעבר כדי לחשב את הנפח המדויק של אצות הנדרש להאכלת היום. פיפטה את הנפחים המחושבים לצינורות 50 מ"מ, וצנטריפוגה ב 5, 000g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאט לאט לשפוך את על טבעי, בזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי לעכל את האצות גלולה. מילוי הצינורות לנפח המקורי שלהם עם מי ים טריים ומסוננים. בהתבסס על תרשים האכלת האצות היומי מהגיליון האלקטרוני, הזן את הכמות שצוינה לכל מקור בשעה 9 בבוקר.m.
12 אחה.m ו-17:.m. ניתן להגדיר משאבת מנון אוטומטית כדי להאכיל את בעלי החיים בשעה 17:.m.
בסופי שבוע ללא נוכחות של צוות culturing. לאחר כל האכלה, לשמור על מזון אצות מוכן בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשמש להזנה הבאה. O.dioica ניתן לאסוף מנמל על ידי גרירה עדינה של רשת פלנקטון שונה מצויד רשת 100 מיקרון וסוף בקלה ללא סינון.
הדגימה בין 2015 ל -19 הראתה שונות עונתית בנוכחות O.dioica בנמלי אוקינאווה. נראה כי טמפרטורת מי הים השפיעה על נוכחותם של בעלי החיים. O.dioica שלט כאשר טמפרטורת מי הים פני השטח היה 28 מעלות ומעלה.
O.dioica בשיתוף פעולה עם Oikopleura longicauda בטמפרטורות שבין 24 ל -27 מעלות. עם זאת, O.longicauda שלט בטמפרטורות מתחת 23 מעלות. שינויים במליחות לא לתאם עם השפע של O.dioica.
שלושת הגורמים החשובים ביותר להקמת מערכות תרבות יציבות של O.dioica הם שמירה על איכות מים גבוהה עם מערכת סינון רב-שלבית, זיהוי משטר הזנה אופטימלי, רצוי על ידי יצירת עקומות תקן אצות, והכנת מקורים הולידו עם מספר מספיק של זכרים ונקבות. בעקבות הפרוטוקול שסופק, מחזור החיים של O.dioica הוא ארבעה ימים ב 23 מעלות. הקמנו באופן אמין שש אוכלוסיות עצמאיות של או.דיויקה, כולן נמשכו יותר מ-20 דורות.
לסיכום, הקמת תרבות יציבה של O.dioica יכולה להיעשות במהירות וחסכונית. עם התקנה נכונה, תרבות יציבה יכולה להיות מושגת בתוך שבוע. בשילוב עם הגנום הקטן שלה ומ מחזור החיים המהיר, זה הופך את O.dioica למין מודל אקורדט רב עוצמה.
ניתן לשמור על O.dioica במי ים מלאכותיים וטבעיים. אחסון ארוך טווח של מזון אצות אפשרי באמצעות תרבות מוצקה והקפאה. בנוסף, זרע O.dioica יכול גם להיות cryopreserved ולהישאר קיימא במשך יותר משנה.
O.dioica ממשיך לספק תובנות רבות עוצמה לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של עונתיות מקומית, מערכת תרבות קפדנית, וכמה אנשים מסורים מאפשרים ליצור תרבות יעילה במאמץ מועט.
