פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על השאלה אם וכיצד שבירה הידראולית משפיעה על חיידקים בנחלים סמוכים ובהרחבה על הנחלים עצמם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אופיה ההוליסטי, שכן היא לוקחת את החוקר מאיסוף דגימות לאורך כל הדרך דרך ניתוח נתונים. מדגים את ההליך יהיה ג'רמי Chansee, bioinformatician במעבדה שלי, סידני ריגל, סטודנט לתואר ראשון במכללת Juniata, וג'יליאן לייסטר, מנהל המעבדה שלי.
כדי לאסוף דגימות משקעים להפקת חומצת גרעין, השתמש בכפפות כדי להטביע צינור חרוט 50 מיליליטר כתרים וסטרילי לתוך מי הנחל מהחוף. בזמן שהצינור שקוע, הסירו את המכסה והשתמשו במכסה כדי לגרוף כשלושה מיליליטרים של משקעים מעומק של ס"מ עד שלושה סנטימטרים לתוך הצינור. לאחר איסוף הדגימה, לזרוק את כל אבל כמיליליטר אחד של מים מתוך הצינור ולהשתמש 1, 000 פיפטה מיקרוליטר להוסיף שלושה מיליליטר של חומר משמר DNA / RNA לדגימה.
מערבבים את הצינור החרוט במשך חמש שניות כדי לערבב ביסודיות את החומר המשמר ולדגום ולאחסן את הדגימה על קרח. עם החזרה למעבדה, לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח DNA 16S או מינוס 70 מעלות צלזיוס לניתוח RNA metatranscriptomics. לאוסף מסננים, מלאו וריקון בקבוק סטרילי שלם של ליטר אחד במי נחל שלוש פעמים כדי להתנות את הבקבוק לפני מילוי הבקבוק בפעם האחרונה.
על משטח יציב, צייר נפח מלא של מי נחל לתוך מזרק מנעול luer סטרילי ולחבר את המזרק לסטרילי DNA / RNA חינם 1.7 ס"מ קוטר פוליאתרסולפון מסנן עם גודל נקבובית 0.22 מיקרון. לשטוף את כל הנפח של מי הנחל דרך המסנן. כאשר נפח המדגם כולו מסונן באותו אופן, למשוך כ 20 מיליליטר של אוויר לתוך המזרק ולדחוף את האוויר דרך המסנן כדי להסיר כל עודפי מים מהמסנן.
לאחר מכן, השתמש במיקרופיט P1000 כדי להוסיף שני מיליליטר של חומר משמר DNA / RNA לפתיחה הגדולה יותר של המסנן תוך החזקת המסנן אופקית עם קצה הפיפטה בחבית המסנן כדי להבטיח כי החומר המשמר נכנס למסנן. לאחר מכן לאטום את המסנן עם ריבועים עטופים היטב של סרט פרפין סביב כל פתח ומניחים את המסנן לתוך שקית מדגם סטרילי על קרח. עם החזרה מדגימה, לאחסן את המסננים עבור 16S או עבור ניתוח metatranscriptomic כפי שהודגם.
לפני תחילת העברת דגימה, לנקות את אזור העבודה עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול. להפקת חומצת גרעין מדגם מ משקעים, השתמש בכלי מתכת מעוקר להבה ואתנול כדי להעביר כ -250 מיליגרם של דגימה לצינור microcentrifuge. להפקת חומצת גרעין מדגם מסנן, השתמש באחיזת סגן מעוקרת 70% אתנול ולהבה כדי לשבור את מעטפת המסנן על המשטח הסטרילי ולהסיר את הליבה מהמעטפת.
השתמש באזמל סטרילי כדי לפרוס בחלק העליון, התחתון, ולאורך התפר של הליבה ולהשתמש פינצטה סטרילית לקפל את נייר המסנן לפני חיתוך אותו לחתיכות קטנות עם האזמל. לאחר מכן מניחים בזהירות את חלקי המסנן לתוך צינור microcentrifuge מבלי ליצור קשר עם משטחים לא סטריליים. עבור תמותה של התאים בתוך כל סוג של מדגם, לחשוף את הצינור לשבש תא במהירות גבוהה.
לאחר חמש דקות לפחות, צנטריפוגה הדגימות ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. הוסף מאגר תמה לסופר-נט ביחס של אחד לאחד והעבר את הפתרון למסנן שסופק. מניחים את המסנן לתוך צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 400 microliters של חוצץ הכנה לצינור.
לאחר צנטריפוגה, להוסיף 700 microliters של חוצץ לשטוף לצינור צנטריפוגה המסנן שוב. לאחר השלכת הזרימה דרך, להוסיף 400 microliters של חוצץ לשטוף לצינור עבור צנטריפוגה נוספת ולהעביר את המסנן לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. כדי לחמוק מהדנ"א, יש לטפל במסנן ב-50 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase/RNase למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
בינתיים, הניחו מסנן HRC של שלושה לתוך צינור איסוף והוסיפו 600 מיקרוליטרים של פתרון הכנה HRC. לאחר צנטריפוגה, להעביר את המסנן לתוך צינור microcentrifuge סטרילי חדש ולהעביר את ה- DNA eluted למסנן עבור צנטריפוגה. הזרימה דרך מכיל את ה- DNA שחולץ.
כדי ליצור ספריית DNA 16S RNA, השתמש תחילה במוצר ה- DNA שחולץ זה עתה להגברת RNA ריבוזומלית 16S עם פרוטוקול PCR סטנדרטי. מערבבים שבעה מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR שנוצר ו-13 מיקרו-לייטרים של מים נטולי DNase ומעמיסים את תמיסת ה-PCR על ג'ל אגרוז של 2%. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 90 וולט במשך 60 עד 90 דקות כדי לבדוק גודל רצועה של 386 זוגות בסיס כעדות להגברה מוצלחת.
כדי לטהר את ספריית ה- DNA 16S ribosomal RNA, מאגר 10 מיקרוליטרים של מוצרי PCR שהניבו רצועות בהירות ו -13 מיקרוליטרים של הדגימות שהניבו רצועות חלשות בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וטענו סביב 150 עד 200 ננוגרם של כל דגימה משולבת לבארות בודדות של ג'ל חדש של 2%. לאחר הפעלת הג'ל כפי שהודגם, יש לסלק את 386 רצועות זוג הבסיס מהג'ל ולהשתמש בערכה מסחרית כדי לטהר את הדנ"א. לאחר מכן לחמוק DNA מטוהר עם 30 microliters של 10 מילימולר טריס הידרוכלוריד ולארוז את הספריות המטוהרות בקרח יבש לפני משלוח לרצף הדור הבא.
בניתוח מייצג זה, כל החילוצים למעט אחד ייקראו מוצלחים. רצועות בהירות שנצפו בעקבות הגברת PCR מצביעות על הצלחה לפרוטוקול 16S. דגימות 16S צריכות להיות מינימום של 1,000 רצפים עם לפחות 5, 000 להיות אידיאלי, בעוד דגימות metatranscriptsomic צריך להיות מינימום של 500, 000 רצפים עם לפחות 2 מיליון להיות אידיאלי.
דגימות משקעים מ-21 אתרים שונים ב-13 זרמים שונים עבור 16S וניתוח מטטרן-ראת-תיאום מוצגים. מתוך אותם 21 אתרים, 12 היו במורד הזרם של פעילות סדיקה וסיווגו כשבירה הידראולית חיובית, ותשעה היו במעלה הזרם של פעילות סדיקה או בקו פרשת מים שבו סדיקה נעדרה ומסווגת כשלילית שבירה הידראולית. כפי שהוערך על ידי ניתוח PERMANOVA, ההפרדה שנצפתה בין שבירה הידראולית חיובית ונתונים שליליים עולה כי דגימות חיובי שבירה הידראולית הושפעו על ידי fracking.
מנבאי היער האקראיים החשובים ביותר היו חושפים אילו תכונות היו חיוניות ביותר להבחנה נכונה של דגימות. אם טקסון מזוהה כחשוב על ידי מודל היער האקראי, פרופיל ההתנגדות האנטי מיקרוביאלית שלו בדגימות חיוביות שבירה הידראולית ניתן להשוות לפרופיל שלה בדגימות שליליות שבירה הידראולית. אם הם שונים מאוד, זה יכול להציע כי נוזל fracking המכיל biocides נכנס לזרם.
חיידקים נמצאים בכל מקום, כך זיהום הוא בעיה פוטנציאלית משמעותית עם סוג זה של עבודה. שלבי ההעברה הראשוניים לדוגמה נוטים במיוחד לכך. אם מישהו מעוניין בהתכלות מיקרוביאלית או בחילוף חומרים אחר, ניתן להשתמש ברצף רובה ציד של RNA כדי לחקור ביטוי גנים מיקרוביאליים פעילים.
טכניקה זו מאפשרת סטנדרטיזציה של טכניקות מולקולריות לחקירת קהילות חיידקים in-situ, כמו גם ניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני רצף חיידקים.
