המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. תפקודם הלקוי הוא מקור ידוע למחלה אנושית. המיטוכונדריה של שמרי בייקר מכילה קידוד גנום עגול שמונה חלבונים.
בסרטון זה, תיארנו את הפרוטוקול המשמש לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים באמצעות תיוג רדיואקטיבי של מוצרים תרגומיים והפרדה עוקבת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. ההליך כולל מספר שלבים עיקריים. שמרים פסים מתרבויות מלאי קפואות על צלחות טריות עם מדיום מתאים.
שים את הצלחות באינקובטור התרבות ב 30 מעלות במשך 24 עד 48 שעות. לחסן תרבויות אלה בשני מיליליטרים של מדיום מן הפס הטרי בצינור 15 מיליליטר ולהדגיר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 מעלות. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך הגל של 600 ננומטר.
קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בתאי שמרים פלטת צינורות סטריליים ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט הזה. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות.
תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט. לדלל תאים בשני מיליליטר של מדיום אגר ניגוב טרי.
קצה הדגירה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות עד הצפיפות האופטית מגיע מ 1.5 ל 1.9 מ 1.5 עד 1.9 ערכים. העבר את נפח התרבות שווה ערך ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרו צנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב3000 G לדקה אחת.
השלך את הסופרנט. לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר להשליך את supernatant.
להשעות מחדש את תאי השמרים ב 0.5 מיליליטר של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מיליליטר. הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית תאים עד ריכוז סופי של 0.2 מיליגרם לכל דגירה מיליליטר במשך חמש דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות כדי לעכב תרגום ציטוזולי.
הוסף מ 25 כדי 30 להוסיף מ 25 כדי 30 מיקרוקורי של S35 מתונין של S35 מתונין כדי התא השעיה דגירה במשך 30 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. הוסף מתונין קר ללא תווית ו borymycin להפסיק את הדגירה תיוג במשך 10 דקות קצה נלקח ב 200 סל"ד ו 30 מעלות. לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9, 000 G במשך 30 שניות.
לשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. תאי שמרי פלט ב 9, 000 G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט.
הוסף 75 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לפלטה ומערבולת במשך חמש עד 10 שניות. הוסף 500 מיקרוליטרים של 0.5 חוצץ tris טוחנת של 0.5 חוצץ tris טוחנת עם pH 6.8. עם pH 6.8.
וורטקס לזמן קצר. הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. וורטקס לחמש שניות.
הוסף 150 מיקרוליטרים של כלורופורם לדגימה. וורטקס לחמש שניות. צנטריפוגה הדגימות במשך שתי דקות ב 12, 000 G.בזהירות להשליך opaface עם סמפלר.
הוסף 600 מיקרוליטרים של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגימות צנטריפוגה במשך שתי דקות ב12, 000 G. להשליך supernatant.
אוויר לייבש את הפלט במשך שתי דקות ב 80 מעלות. ממיסים חלבונים מזורזים ב-60 מיקרוליטרים של מאגר מדגם לאמלי. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 14 מעלות.
סיבה 17.5% Laemmli SDS פוליאקרילמיד ג'ל. טען 15 מיקרוליטרים של כל דגימה בכיסים. הפעל את הג'ל בחדר הקר עד הצבע הכחול מגיע כ 65% של הלימפה ג'ל.
הכתים את הג'ל בכחול מבריק של קומאסי ובצע סריקה או תמונה הנדרשת כבקרת טעינה. יבש את הג'ל במייבש הג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון במשך שלושה עד חמישה ימים.
סרוק את המסך על תמונה זרחנית. בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זנים Saccharomyces cerevisiae. הסוג הפראי ומחיקת וריאנט המוטנטים של קידוד הגן Aim23 גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי שלוש.
מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי כבר סומנו באופן פעיל והופרדו בג'ל פוליאקרילמיד דנאטורי. הדגימות נאספו כל שתיים וחצי דקות לפני הרוויה כדי לבנות את מסלול הזמן. הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת חמשת הימים.
במקרה של ניסוי מוצלח, התמונה מדגימה שמונה להקות שהוקצו על פי התבנית הסטנדרטית. עם זאת, העוצמות של להקות בודדות יכולות להיות משתנות מאוד בהתאם למתח ולתנאים הניסיוניים. כל להקה מתאימה למוצר תרגום אחד.
הנתונים מצביעים על כך שזן המוטנטים מסוגל לסינתזת חלבונים מיטוכונדריאליים מכיוון שכל המוצרים המופיעים בסוג הפראי נראים במוטנט זה. עם זאת, העוצמות של הלהקות שונות מהסוג הפראי, כלומר מחיקה זו של Aim23 משפיעה על ביטוי הגן המיטוכונדריאלי. קומאסי מבושל בכתם כחול ומשמש כבקרת טעינה.
ניתן לכמת את התוצאה שלהם בנתונים כדי לזהות הבדלים בין זנים או תנאים ניסיוניים באמצעות תוכנת Image G או Image Quan. עבור אלה, היחס בין האות המתאים לכל מוצר מחושב לאות הכולל. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מחושבים בשלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות.
הקינטיקה של חלבון מסונתז שהתהפך נחקרת בניסוי שנערך בשנה שעברה. דגימות נאספות בנקודות הזמן שצוינו לאחר תגובת התיוג נעצרת על ידי מתיונין קר ו borymycin. בקרה זו נחוצה כדי להעריך את יציבות המוצר.
מכתים אימונים עם נוגדנים נגד פורין אחד הוא בקרת טעינה. תיארנו את השיטה, המשמשת לעתים קרובות לחקר ביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה של שמרים. פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית ומהיר לביצוע.
במקביל, הוא מאפשר לקבל מידע רב ערך על שיעור התרגום של ארבעה שמרים מיטוכונדריאלי mRNAs, וזה יתרון מאוד. עם זאת, יש לו מספר מגבלות הדורשות ניסויים נוספים טמון זה רמות interstate של חלבונים mRNAs. זה יכול לספק את המידע על פונקציות אלה במערכת תרגום מיטוכונדריאלי, אבל טכניקות מתקדמות יותר יש להשתמש כדי לגלות את המנגנון.
