פרוטוקול זה נועד לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטת פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול מתאים לזני השמרים שלנו המתוחזקים בתנאי גדילה שונים. ייצוג כלי רב עוצמה למחקר כמו לימוד המיטוכונדריה.
ראשית, תאי פסים ממלאי הגליצריול מאוחסנים ב 80 C, על צלחת אגר YPD כדי לבודד מושבות בודדות מן המתח של עניין. ודגרת הצלחת ב 30 C במשך 2 עד 3 ימים. הכן תרבות המתנע על ידי חנק 2 עד 3 מושבות בודדות מצלחת אגר YPD בבקבוק ארלנמאייר 100 מ"ל המכיל 10 עד 30 מ"ל של מדיום YPGal.
לדגור על הבקבוקון ב 30 C במשך 24 שעות עם רועד נמרץ ב 180 עד 200 סל"ד. לדלל את תרבות המתנע לתוך 1 ליטר של בינוני YPGal טרי לצפיפות אופטית פחות מ 0.1 ב 600 ננומטר. לטפח את התאים ב 30 C עם רועד נמרץ ב 180 עד 200 סל"ד במשך כ 12 שעות, עד צפיפות אופטית מגיעה 1 עד 1.5.
בצע את הבידוד של המיטוכונדריה המטוהרת ביותר כמתואר בטקסט. ולקבוע את ריכוז החלבון של הכנת המיטוכונדריה המטוהרת ביותר, באמצעות ברדפורד, בעקבות הוראות היצרן. התאם את ריכוז החלבון ל-10 מ"ג/מ"ל עם חוצץ SEM קר כקרח.
מעבירים 40 ליטר של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד לארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש ומסומנים. הוסף 360 l של מאגר SEM בצינור הראשון והשני. ו-360 ליטר של חיץ EM בצינורות השלישי והרביעי.
באמצעות ערכת pipetting, לפי הטקסט, להוסיף 4 ליטר של חלבון טרי מוכן K בצינור השני והרביעי. לאחר ערבוב כל הצינורות בעדינות, לדגור על קרח במשך 30 דקות עם ערבוב מדי פעם. כדי לעצור את פעילות proteinase K להוסיף 4 L של 200 mM PMSF לכל ארבעת הצינורות.
צנטריפוגות הצינורות ב 20, 000 x g במשך 30 דקות ב 4 C.ולאסוף את supernatant, מבלי להפריע את הכדור, לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל מקורר מראש. לאחר מכן, יש להזרים את הכדור ב-400 ליטר של חוצץ SEM קר כקרח. כדי לנטרל את העקבות האפשריים של פרוטאינאז K, לזרז את supernatant שנאסף מחדש את הכדור עם חומצה טריכלורואצטית לריכוז סופי של 10%לדגור על הצינורות על קרח במשך 10 דקות.
צנטריפוגות חומצה טריכלורואצטית שטופלו דגימות במשך 10 דקות ב 12, 000 x g ב 4 C.ולאחר הסרת supernatant, resuspend הכדור ב 200 l של חוצץ מדגם. אם הכחול ברומופנול הופך צהוב, להוסיף 1 עד 5 l של בסיס טריס 1 M, עד שהוא הופך כחול. הוסף 4 l של 200 mM PMSF לכל הצינורות.
אחסן את הדגימות ב 80 C עד ניתוח נוסף על ידי SDS-PAGE ו כתם מערבי. מעבירים 200 ליטר של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד לצינור מיקרוצנטריפוגה מצונן מראש של 1.5 מ"ל. לדלל את המיטוכונדריה פי אחד עם חוצץ SEM קר כקרח.
באמצעות sonicator תואם עם כרכים קטנים, sonicate mitochondria 3 פעמים במשך 30 שניות על קרח. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100, 000 x g ב 4 C.ולאסוף את supernatant חדש 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge מצונן מראש. לאחר תיוג הצינור כ- S"עבור שבר חלבון מסיס, שמור את הצינור על הקרח.
resuspend הכדור מהשלב הקודם ב 400 l של חוצץ SEM קר כקרח. מעבירים 100 ליטר מהכדור המחודש לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מצונן מראש ב-1.5 מ"ל. תייג את הצינור כ- SMP"עבור חלקיקי גישושנדריאליים שבר, ולשמור את הצינור על קרח.
לדלל את 300 l הנותרים של גלולה resuspended קיפל אחד עם מוכן טרי 200 mM נתרן קרבונט. ותדגירה את הדגימה המדוללת על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך 30 דקות ב 100, 000 x g ב 4 C.לאסוף את supernatant לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צונן מראש.
סמן את המדגם כ-CS עבור שבר על-טבעי פחמתי, ושמור את הצינור על הקרח. resuspend הכדור מהשלב הקודם ב 400 l של חוצץ SEM קר כקרח. ותנו שם לדגימה כ-CP עבור שבר מוגז מוגז.
לזרז את כל הדגימות עם חומצה טריכלורואצטית לריכוז סופי של 10%ולדגירה את הצינורות על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 12, 000 x g ב 4 C.לאחר הסרת supernatant, resuspend כל גלולה במאגר המדגם. אם מאגר הדגימה הופך לצהוב, הוסף 1 עד 5 ליטר של בסיס 1 M Tris עד שהוא הופך לכחול.
הוסף 1 ליטר של 200 mM PMSF לכל הצינורות ולאחסן ב 80 C עד ניתוח נוסף על ידי SDS-PAGE ו כתם מערבי. השבר המיטוכונדריאלי הגולמי טוהר על צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז, וירידה במזהמים תאיים אחרים נצפתה. המיטוכונדריה להמרת המיטופלסטיסט היו במעקב על ידי היעלמותו של חלבון החלל הבין-ממבריצי ציטוכרום b2 בכדור.
עם המראה הנקוב בסופר-טבעי. החלבון K תיווך השפלה של חלבון intermembrane Sco1 נצפתה עקב הפרעה ממברנה החיצונית על ידי הלם אוסמוטי. שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית אושרה על ידי ההגנה של ציטוכרום b2 ו- Sco1 מפני השפלת חלבון K בשבר הכדור.
באופן דומה, ההגנה על החלבון המסיס במטריצה KGD אישרה את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית. פרופיל כתם מערבי Prx1 הציע לוקליזציה מיטוכונדריאלית כפולה בחלל ובמטריצה בין-משרדית. המיטוכונדריה היו נתונים sonication ומיצוי קרבונט כדי לחקור את הטופולוגיה של חלבונים ממברנה.
שפכיית חלבון הממברנה האינטגרלית נשארה בשברירי הכדור. הקג"ד זוהה בשבר העל-טבעי. גילוי של חלבון KGD בכדור נבע וריאציות פרמטר sonication המשפיעים על היווצרות של SMPs.
לאחר טיפול נתרן קרבונט, ה- KGD ושבר SMP היו solubilized ונמצא בשבר supernatant. פרופיל כתם מערבי Prx1 הציע קשר עם פריפריה ממברנה. להצלחת פרוטוקול הפירוק של ההגשה, חשוב להפסיק את פעילות ה-K של פרוטאינאז לאחר נפיחות היפוטונית על ידי הוספת PMSF לדגימות.
אתרים מספקים מידע על לוקליזציה של חלבון גישושנדריאלי. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את השלמות של תכשירים מיטוכונדריאליים, שהוא בסיסי במהלך מחקרים פרוטאומיים של תת-מחשבים מיטוכונדריאליים.
