אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות הביוריאקטור התלת-ממדי שלנו. אקסוזומים אלה יכולים לשמש במחקר ביולוגיה של אקסוזומים ובטיפול קליני בדלקת פרקים. המדגים את ההליך יהיה ד"ר יוג'יה ליאנג.
התחל לאסוף את התאים המזנכימליים האנושיים, או MSCs, על ידי צנטריפוגה של הנוזל הסינוביאלי ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את כדור התא עם 10 מיליליטר של PBS. צנטריפוגה של התאים המחודשים ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך PBS לפני החייאת הכדור עם 10 מיליליטר של תרבית MSC אנושית בינונית בצפיפות תאים של חמש פעמים 10 לתאים הרביעי למיליליטר ולאחר מכן צלחת את התרחיף בצלחת 100 מ"מ.
דגירה של המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% פחמן דו חמצני. לאחר שבועיים, אספו את תרבית התאים כדי לזהות תאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי, או SF-MSCs, באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי לעשות זאת, לעכל את הדור השלישי לעבור שלושה של SF-MSCs על ידי צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט לפני איסוף גלולת התא. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של המאגר החוסם את הכדור התא בריכוז של חמש פעמים 10 עד הרביעי ולאפשר את הכדור לעמוד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, צנטריפוגה של השעיית התא כפי שתואר קודם לכן, ולאחר מכן להשעות את הכדור מופרד ב 100 microliters של 1X PBS.
מוסיפים מיקרוליטר אחד של הנוגדן הפלואורסצנטי החד-שבטי ביחס דילול של 1:100 לכל צינור כמתואר בכתב היד, ומניחים את הצינור לדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים עם 1X PBS והחזירו את התאים ב-100 מיקרוליטרים של 1X PBS. לאחר מכן, לזהות את fluorophores עד 10, 000 תאים על ציטומטר זרימה באמצעות ערוצים אדומים ו- FITC.
כדי להכין את המיקרו-קרוואנים, יש להתנפח ולייבש 0.75 גרם של המיקרו-קרונות ב-1X DPBS בריכוז של 50 מיליגרם לגרם למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לטשטש את ה-supernatant כדי לשטוף את המיקרו-קרונות ב-DPBS טריים למשך חמש דקות. לאחר החלפת המדיום ב-DPBS 1X טרי ב-50 מיליגרם של המיקרו-קרונות לגרם, יש לעקר את המיקרו-קרקרים על ידי אוטוקלאבינג בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-15 פאונד לאינץ' מרובע.
לאחר מכן, אפשרו למיקרו-קרוואנים המעוקרים להתיישב לפני שהם מנטרלים את הסופר-נטנט. שוטפים את המיקרו-קרונות במדיום התרבית בריכוז של 50 מיליגרם של המיקרו-קרונות לגרם בטמפרטורת החדר. כאשר microcarriers מיושבים, להשליך את supernatant.
כדי להכין ביוריאקטור פרפוזיה, לעקר את הביוריאקטור על ידי אוטוקלבינג כפי שתואר קודם לכן. בסיום, יש לספור את מספר ה-SF-MSCs שיש להקצות 2.5 כפול 10 ל-SF-MSCs השביעי ואת המיקרו-קריינות לביו-ריאקטור עם 250 מיליליטר של מדיום תרבית MSC ברמת GMP. מניחים את הביוריאקטור באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במהירות של 15 סיבובים לדקה.
שנה את מדיום התרבות כל שישה ימים. לאחר 14 יום, אספו את תרביות התאים ואת המיקרו-קריינות להמשך ניתוח. צנטריפוגה של תרבית התאים ב-300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואיסוף הסופר-נטנט תוך השלכת פסולת התאים.
בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ברצף את supernatant ב 2, 000 פעמים G במשך 10 דקות ולאחר מכן ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות כדי להשליך את שלפוחית גדולה יותר ולאסוף את הכדור. לאחר החייאת הכדור ב 40 מיליליטר של PBS, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 120, 000 פעמים G במשך 70 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשעות את הכדור שנאסף המכיל אקסוזומים ב 500 microliters של PBS.
לדלל את דגימות האקסוזום שבודדו זה עתה עם PBS סטרילי לריכוז של 10 עד 7 עד 10 עד החלקיקים התשיעי למיליליטר ולהזריק 500 מיקרוליטר של הדגימה עבור כל ריצה לתוך ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או מערכת NTA, ב 30 מיקרוליטר לדקה ו 24.4 עד 24.5 מעלות צלזיוס. הגדר ידנית את מערכת הלכידה והניתוח בהתאם לפרוטוקול היצרן. דמיינו את החלקיקים על ידי פיזור אור לייזר ולכדו את התנועה הבראונית שלהם בווידאו דיגיטלי.
לאחר מכן, נתח את קלטות הווידאו המוקלטות באמצעות תוכנה, תוך מעקב אחר לפחות 200 חלקיקים בודדים בכל ריצה. עבור כתם מערבי, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ הליזיס ומעכבי פרוטאז לאקסוזומים עם ערבוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, אפשרו להם לעמוד על הקרח במשך 20 דקות.
לאחר צנטריפוגה של התערובת ב 9, 391 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, למדוד את ריכוז החלבון supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבון. לאחר הבדיקה, מחממים את הדגימה עם 100 מיקרוליטרים של חיץ העמסת חלבון 4X בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, טען 15 מיקרוליטרים של חלבונים בריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר כדי לרוץ על ידי אלקטרופורזה ג'ל ב 120 וולט במשך 70 דקות, ואלקטרו-כתם ב 100 וולט במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
זהה את הסמנים הספציפיים שאינם אקסוזומים, כגון calnexin ואת הסמנים הביולוגיים האקסוזומליים כגון CD9, CD63 ו- CD81 על ידי כתם מערבי פלואורסצנטי. במחקר, ציטומטריה של זרימה שימשה לזיהוי סמני פני השטח של SF-MSCs. ניתוח ציטומטריה של זרימה גילה כי SF-MSCs בתרבית היו שליליים עבור CD34, CD45 ו- HLA-DR, וחיוביים עבור CD73, CD90 ו- CD105, ועמדו בקריטריוני הזיהוי של MSCs.
תחת מיקרוסקופיה הפוכה, הבחין כי SF-MSCs להתרבות על microcarriers. ה-SF-MSC התפשט בתרבית תלת-ממד מהר יותר משישה ימים ואילך בהשוואה לתרבית דו-ממדית. האקסוזומים מ-SF-MSCs של תרבית דו-ממדית ותלת-ממדית זוהו באמצעות כתם מערבי ונמצא כי האקסוזומים מבטאים CD63, CD9 ו-CD81 בעוד שהם שליליים עבור קלנקסין.
ניתוח הננוציטים הראה כי הקוטר של אקסוזומים דו-ממדיים ותלת-ממדיים הוא כ-120 ננומטר. הניתוח המיקרוסקופי של אלקטרונים בהולכה חשף את המורפולוגיה של אקסוזומים דו-ממדיים ותלת-ממדיים, והראה שלפוחיות כדוריות בערך. באמצעות ניתוח NTA נותח הריכוז של חלקיקים בגודל 30 עד 160 ננומטר.
לאחר תרבית תלת-ממדית, ריכוז החלקיקים היה 4.0 כפול 10 עד 6 למיליליטר. עם זאת, לאחר התרבית הדו-ממדית, הריכוז של חלקיקים זהים היה 2.5 כפול 10 עד 6 למיליליטר. יתר על כן, תרבית תלת-ממדית ייצרה יותר חלבון אקסוזום מאשר תרבית דו-ממדית.
הניתוח המייצג מראה את ההפנמה של אקסוזומים המסומנים בדיל על ידי כונדרוציטים ראשוניים. ניתן לראות אקסוזומים עם תווית דיל שנכנסו לכונדרוציטים ראשוניים עם שיא של שלוש שעות. מחקר במבחנה הראה כי אקסוזומים יכולים להעביר מיקרו-רנ"א-140 עם תווית סולפו-ציאנין3 לכונדרוציטים.
ציפוי התאים, התחלת התגובה בביוריאקטור, ושל הסופר-נטנט הם השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה. תרבית תלת-ממדית משמשת בדרך כלל לתרבית בקנה מידה גדול של תאים דבקים. שיטות אחרות כגון ספין פלקס יכולות לשמש גם לייצור בקנה מידה גדול של אקסוזומים.
השיטה שלנו משפרת את התפוקה של אקסוזומים, ובכך מאפשרת יישום פרה-קליני מבוסס אקסוזום MSC.
