מימון עבור עבודה זו סופק על ידי NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, ו-NIH R56 AI063274

<ol>
	<li>Shi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+large-scale+pharmacogenetic+studies+by+high-throughput+mutation+detection+and+genotyping+technologies.">Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.</a> Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).</li><li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+by+the+5'-nuclease+reaction.">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction.</a> Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).</li><li>Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+by+the+5'-nuclease+reaction:+advances+in+high+throughput+genotyping+with+non-model+organisms.">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms.</a> Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).</li><li>Bay&#233;s, M., Gut, I. G., ed, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Genotyping.">Overview of Genotyping.</a> Molecular Analysis and Genome Discovery. , 1-23 (2011).</li><li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Polymorphisms+for+High-Throughput+Genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+Southern+Africa.">Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa.</a> J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+Genotyping+Platforms.">SNP Genotyping Platforms.</a> Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , 123-132 (2011).</li><li>Shen, R., Fan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+SNP+genotyping+on+universal+bead+arrays.">High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays.</a> Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).</li><li>Ragoussis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+technologies+for+all.">Genotyping technologies for all.</a> Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).</li><li>Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Genome+Detection+of+Disease-Associated+Deletions+or+Excess+Homozygosity+in+a+Case-Control+Study+of+Rheumatoid+Arthritis.">Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li><li>Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+bipolar+disorder+susceptibility+alleles+and+identification+of+two+novel+genome-wide+significant+associations+in+a+new+bipolar+disorder+case-control+sample.">Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample.</a> Mol. Psychiatry. , (2012).</li><li>Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+five+susceptibility+loci+for+glioma.">Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma.</a> Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).</li><li>Inc Illumina. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).</li><li>Turner, S., Armstrong, L. o. r. e. n. L., Yuki Bradford, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Control+Procedures+for+Genome+Wide+Association+Studies.">Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies.</a> Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).</li></ol>

יש המחברים של מאמר זה אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

יישומי גנוטיפ בקנה מידה גדול שנוצלו כדי להבין את המנגנון הגנטי שבבסיס מחלות רבות אדם טוב יותר. הגילוי של כל גרסה משמעותית באמצעות ניתוח עמותה הגנום יכול דגל אזור מועמד למחקר נוסף. בנוסף, נתוני גנוטיפ הוא כלי טוב לבקרת איכות בפרויקטים לקביעת רצף. כדי למקסם את תפוקת מדגם, יכולות להיות מוגברות צלחות מדגם מרובות ומאוחסנות במדינות מקוטעות, המושעות שלהם. שמונה צלחות עשויות להיות מוגברות ביום אחד, המשלבות את 24 שעות הראשונות של הפרוטוקול לקבוצות מרובות ומספקים מספיק חומר ל~ 2-8 ימים לעיבוד שבבים. אם צלחות מוגברות במאגרי נשק לפני כן, ואם הדגימות חדשות הם הכלאה לשבבים מייד לאחר הסריקה מתחילה בריצה הקודמת, עיבוד יכול לרוץ ברציפות ללא הצורך להשהות להכנת מדגם נוספת. לכן, למרות שהדגימות ייקחו שלושה ימים לעבור מלאassay, יכול להיות שנוצרו נתונים יומיים. שבבי Assuming24 מעובדים בכל יום, שבוע עבודה של 5 ימים מאפשר ללמעלה מ 1,000 דגימות ה-DNA שיופעל על 12 מדגם שבב חרוז. אם כל צעד או מגיב נכשל, לעומת זאת, קבוצות מרובות עלולות להיות בסיכון לביצועים גרועים לפני שניתן יהיה ליישם בכל תיקון. שגיאות עלולות להימלט הודעה עד למערכים נסרקים או נותחו, ולכן, אם התפוקה מוגדלת, מאות דגימות בשלבים שונים של הפרוטוקול אולי כבר קיבלו את אותו טיפול פגום עם גילוי. כפי שלא ניתן לשחזר חומרים כימיים והנתונים שאבדו, המשתמש חייב לשקול את הסיכונים הללו כנגד הצורך בעבודה מואצת. תוכנת ניתוח GenomeStudio היא ההזדמנות הראשונה באמת כדי לאמוד את ההצלחה של תהליך גנוטיפ. אם הנור-R לעומת חלקות עוצמת הנור תטא מקובצים כראוי, שיעור השיחה הממוצע (אחוזים מסך SNPs הוקלדו בהצלחה) של הדגימות צריך גישת 99%, למרות שערך זה משתנה SLIghtly בהתאם לסוג מערך. נתונים מכל דגימה עם שיעור שיחה נמוך יותר מאשר 85-90% הוא לא אמינים וצריכים להיות מושלך. למטרות בקרת איכות, יש להשוות את תוצאות לכל גנוטיפים בכל הזדמנות אפשריים ידועים קודם לכן. אין נתונים כאלה, אם קיימים, שכפול מדגם מכוון הוא כלי שימושי באימות מיקומי צלחת או מערך. זוגות כפולים אלה צריכים להיות ממוקמים על שבבים נפרדים, צלחות, קבוצות, או פרויקטים; גנוטיפים שלהם בדקו על דור. אמנם אילוצי QC ספציפיים משתנים בהתאם להעדפתו של החוקר, אילוצי SNP משותפים מבוססים על הצלחה שיחת מדגם, שיווי משקל הארדי-ויינברג, או missingness בין המקרים ובקרות, ואילו אילוצי מדגם נפוצים מתבססים על שיעורי שיחה, חוסר עקביות מנדל, או הפניות מקושרות הטרוזיגוטיות כרומוזום ה-X לנתוני מגדר קליניים [13]. אם מתעוררת בעיה כלשהי, לוח המחוונים הפקדים, שנמצאו בחבילת הניתוח, ניתן להגיש לחברה על מנת לקבוע גורם. בקרות אלה יכולים לעתים קרובות לצמצם את הנושא לצעד הסביר ביותר או הכישלון מגיב. אם כל SNPs של עניין נמצא בניסוי גנוטיפ Infinium, חלקות העצמה שלהם צריכה להיות בGenomeStudio לשגיאות באשכולות לפני מחקר נוסף שנערך בדק כפולות. ניסוי גנוטיפ Infinium נכשל הוא כנראה עקב שגיאת עיבוד אנושית או DNA קלט באיכות ירודה. כימות מדגם חייבת להיות מדויקות ומדויקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, כל חומרים כימיים הוסיפו לכל מדגם או שבב חייב להימכר בהיקף שנקבע על ידי הפרוטוקול. טפטפות חייבת להיות מכוילת כראוי. ריאגנטים לא צריכים לרוץ אחרי פקיעה ולא צריך להיות refrozen פעם מופשרת, לחסוך למגיב RA1. על מנת למזער טעויות מכתים והארכה אפשריות, תערובת פוראמיד / EDTA צריכה להיות מוכנה טרי בכל חודש. כל -20 ריאגנטים C ° צריכים להיות מאוחסנים במקפיאים ידני להפשיר בלבד. כל מעבדתי בשימוש בstaining, סיומת, ולשטוף את החלקים בפרוטוקול יש לשטוף היטב במים וסבון עדין מייד עם חוסר שימוש. מאגרי humidifying בתא היב צריכים להשתפשף עם מברשת מבחנה וחומר ניקוי עדין. שקופיות הזכוכית יש לשטוף עם אקונומיקה 10%, כפי שהורו על ידי המדריכים למשתמש שלהם, פעם בשבוע.

הקלדת פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) היא שיטה העיקרית של זיהוי וריאנטים סיכון הקשורים למחלות. מבחינה היסטורית, את היקף ניסויי גנוטיפ היה מוגבל על ידי הטכנולוגיה זמינה. שיטות גנוטיפ מבוססות ג&#39;ל אלקטרופורזה מוגבלות במדגם וSNP תפוקה [1]. פיתוח מבחני אלה לעתים קרובות יכול להיות עתיר עבודה, בהסתמך על האיפור ומבנה באזור המקיף את הגרסה לאופטימיזציה [1]. מבחני גנוטיפ TaqMan, שפותחו על ידי חיים טכנולוגיים, יכולים להריץ מספר גדול של דגימות במהירות ועם מעורבות מינימאלית טכנאי [2], אבל הגבלות SNP-ריבוב ימשיכו להגביל את המספר הכולל של גנוטיפים להיטב תחת מיליון ליום [3,4 ]. פלטפורמת iPlex של Sequenom יכולה לרוץ גם דגימות רבות בבת אחת, אבל, כפי שניתן multiplexed פחות ממאה SNPs יחד, התפוקה היא נמוכה comparably כללי [5]. טכנולוגית זרם SNP של בקמן קולטרבאופן תיאורטי יכול לייצר יותר משלושה מיליון גנוטיפים ליום, אבל טווח פרויקט גבולות טכנולוגיה זו עד למקסימום של רק ארבעים ושמונה SNPs לכל תגובה [4,6]. בעוד assay GoldenGate יכול לעבד כמעט מאתיים דגימות DNA בכל יום במאה או אלפי SNPs לפי מדגם, המחיר לכל גנוטיפ הוא לא תחרותי עם טכניקות מתקדמות, Ultra-תפוקה גבוהה בעת הקלדה למעלה משלושה אלף SNPs בפעם אחת [4,7 ]. כדי לעבד כמה מיליוני גנוטיפים ליום, בקנה מידה הנדרשת ללימודי עמותה הגנום גדולים, מבחני מערך כלאה הפכו את האפשרות חסכונית ביותר בשוק. הקו של Affymetrix של מערכי הכלאה והשורה של Illumina של מערכים מבוססי Infinium יאפשר פוטנציאל של מאות דגימות להיות מוקלדים במאה אלפים או מיליון של SNPs ב[ 4,8] המקביל. יכול להיות מפוזר SNPs אלה על פני הגנום כולו, מקומי באזורים של אינטרסים, כגון לשעברomes, או מותאם אישית להעדפותיו של המשתמש. יש מערכים אלה את היתרון של להיות לא רק מסוגל גנוטיפ במדויק מיליון SNPs לדגימה בבת אחת, אלא גם כדי למדוד וריאציה עותק מספר, פגמים בכרומוזומים פוטנציאלי הסרת לוט. יש מערכי OMNI BeadChip מיושרים-Infinium כיום היכולת גנוטיפ עד כמעט חמישה מיליון סמנים לדגימה, כוללים חצי מיליון לוקוסים מותאמים אישית, על עד כמעט מאה דגימות בכל יום. כמו רוב המחלות מרכיב גנטי, ניסויים בקנה מידה גדולה אלה יכולים להיות מכריעים במציאת גנים הקשורים למחלה. גנוטיפ תפוקה גבוהה מאפשר לדור גנוטיפ יעיל במדגם קבוצות גדולים מספיק כדי לזהות קשר גנטי בצורה משכנעת בתדרי אלל קטין נמוכים יותר. פרויקטי גנוטיפ הגנום כולו ניתן להשתמש כדי לאתר אזורים בתדירות משמעותית מבחינה סטטיסטית שליטה במקרה אלל או הבדלי עותק מספר [9,10,11]. לדברי גה האדם הלאומינומו מכון מחקר, מחקרי עמותה הגנום הובילו ל1,490 פרסומים נפרדים בין 25 נובמבר 2008 ו -25 ינואר 2013, הנובע מגילוי 8,283 SNPs עם p-value של פחות מ 1 x 10 -5 (ראה http:// www.genome.gov/gwastudies/). מחקרים אלה, שחקרו תנאים החל גובה לסרטן אשכים, נהנה מהגישה הרחבה המוענקת על ידי ניתוח הגנום כולו. במקרים כגון אלה, אזורים שלמים של עניין שאולי חמקו מתשומת לב שההיקף של הקלדה היה מגביל מדי. לפיכך, לעמותה בקנה מידה גדולה מנתח, טכניקת גנוטיפ הגנום היא הטכניקה של בחירה. גרסאות שונות של assay Infinium קיימות, שכל אחד מיועדת לשימוש עם סוגים מסוימים של מערכים. Assay InfiniumUltra, דן לעומק בהמשך, הוא מתאים עבור רבים 12 - או שבבי מערך 24 מדגם. אלה לעתים קרובות גנוטיפ למעלה ממאה אלף SNPs לדגימה ה-DNA ולהתמקד בלאאזורי argeted, כגון על לוחות exome או מותאמים אישית. גרסאות assay אחרות ייתכן שתידרשנה לסוגי שבבים אחרים, כגון מערכי גנוטיפ הגנום כולו. עם זאת, כמו כל מבחני Infinium חולקים בסיס משותף ובעיקר שונים רק על ידי השמות מגיב, כרכים מגיב, או הליך מגיב מכתים המדויק, טכניקות שיכללו בגרסת assay אחד יכולה לעתים קרובות להיות מיושמות באופן אוניברסלי. מערכים אחרים, כגון מערכי מתילציה, עלולים להשתמש בפרוטוקול כמעט זהה, גם כן. יש להקפיד להשתמש אך ורק את הגרסה של assay הנדרש לסוג השבב בשימוש. סוגים מסוימים, כגון אלה מדידת רמת ביטוי גנים, עלולים לדרוש שימוש בפרוטוקול nonInfinium. דגימות חייבות להיות מעובד בקבוצות. לדוגמא, עם assay InfiniumUltra, צינורות מגיב prehybridization מכילים מספיק נפח לרוץ 96 דגימות, ולא ניתן refrozen הצינורות. לכן, דגימות חייבות להיות מנוהלות בקבוצות של 96 דגימות בכל פעם. הדגימות יהיו מוגברות בעצי האשוחיום לא. לאחר כ 1 שעות של benchwork, הדגימות חייבות להיות מחוממות בתנור הסעה ל20-24 שעה. למחרת היום, כמעט 4 שעות יוקדש פיצול, מזרז, וresuspending הדגימות, ובשלב זה יכול גם להיות קפוא הדגימות לשימוש עתידי, או הכלאה לשבב. טוען שבבים לוקח כמעט שעה 2, לאחר שהדגימות יהיו הכלאה בין לילה ל16-24 שעה. ביום השלישי, שלב הצביעה והסיומת לוקח ~ 4 שעות. שעה נוספת יוקדש כביסה, ציפוי, ומייבש את השבבים. לבסוף, המערכים נסרקים, אשר עשוי להימשך 15-60 דקות / שבב, תלוי בסוג שימוש. אמצעי בטיחות במעבדה וניקיון התקן חלים. למרות שאינה מבוססת-PCR ההגברה, תחנות עבודה נפרדות ולמראש postamplification נהלים נחוצות כדי למזער את הסיכוי לזיהום. מספר זיהוי של כל מגיב-סיפק ערכה בשימוש חייב להיות מחובר גיליון מעקב. ריאדNTS צריך להיות מופשר מייד לפני השימוש והפוך כמה פעמים בעבר מחלק. ה-DNA להיות מוקלדים חייבת להיות DNA באיכות גבוהה גנומית (260/280 יחס ספיגה 1.6-2.0, 260/230 יחס ספיגה מתחת 3.0), שבודד על ידי שיטות סטנדרטיות ולכמת עם fluorometer. השפלה של ה-DNA היא לעתים קרובות גורם תורם בassay תוצאות באיכות נמוכה. בדרך כלל, 200 ng של DNA הנדרש, אם כי סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לסוגים מסוימים שבב. רובוט טיפול נוזלי טקאן יכול להפוך שלבים רבים של הפרוטוקול ולמזער טעויות אנושות כגורם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

גרסאות Genotyping בגנום האנושי הוכיחו להיות שיטה יעילה לזיהוי קשרים גנטיים עם פנוטיפים. ההפצה של גרסאות בתוך משפחות או אוכלוסיות יכולה להקל על זיהוי של הגורמים הגנטיים של מחלה. הפנל של Illumina של BeadChips גנוטיפ מאפשר לחוקרי גנוטיפ אלפים או מיליונים פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) או לצורך ניתוח וריאנטים אחרים גנומי, כגון העתקת מספר, על פני מספר גדול של דגימות דנ&quot;א. ניתן להפיץ SNPs אלה לאורך כל הגנום או ממוקד באזורים מסוימים על מנת למקסם את פוטנציאל הגילוי. Assay Infinium עבר אופטימיזציה כדי להניב איכות גבוהה, תוצאות מדויקות במהירות. עם התקנה נכונה, טכנאי אחד יכול לעבד מכמה מאה ליותר מאלף דגימות DNA בשבוע, תלוי בסוג של מערך. assay זה מנחה את המשתמשים בכל שלב, החל מהדנ&quot;א הגנומי וכלה בסריקה של המערך. שימוש בריאד התקינותNTS, דגימות הם מוגברות, מקוטעים, זירז, resuspended, הכלאה לשבב, הוארכה בסיס יחיד, מוכתם, ונסרק שתי מערכת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה iScan או היי סריקה. צעד לילה אחד נדרש כדי להגביר את ה-DNA. ה-DNA הוא מפוגל ומוגבר isothermally ידי הגברה הגנום כולו, ולכן לא נדרש-PCR. דוגמאות הם הכלאה למערכים במהלך צעד הלילה שני. ביום השלישי, הדגימות מוכנות לסריקה ונותח. ה-DNA המוגבר עשויה להיות מאגרי הנשק בכמויות גדולות, ומאפשר למערכי חרוז להיות מעובד בכל יום בשבוע, ובכך למקסם את התפוקה.

שבב חרוז כראוי מעובד צריך להציג עוצמות לייזר האור אדומות וירוקות בהירות וברורות בעת הסריקה. באיור 6, תוכנת סריקת iScan מציגה דגימת DNA הגנומי סטנדרטית הכלאה בהצלחה למערך genotyping SNP מותאם אישית בלוח. נוקלאוטידים שהכותרת שצורפו במהלך שלבי הרחבה ומכתים לזרוח תחת האורות של שני לייזרים. כנוקלאוטידים אלה באופן סלקטיבי להאריך שרשרת oligonucleotide של חרוז הכלאת גדיל DNA המקוטע, וכמו שרשרות oligonucleotide נועדו לסיים באתר של הגרסה, את הצבע ואת עוצמת האות וכתוצאה מכך יכולים לשמש כדי לקבוע את אללים נוכחים ב אתר SNP. גיליון נוצר על ידי משתמש מדגם, אשר תואמה את תעודות זהות של מדגם ומידע קליני לchipID ועמדה, ומניפסט SNP מערך ספציפי, המתקבל ישירות מהחברה, שניהם הכרחיים על מנת לייבא את SCAקבצי פלט nner לתוך תוכנת ניתוח GenomeStudio. ניתן למצוא גיליונות מדגם דוגמא באתר האינטרנט של החברה. ברגע שפרויקט GenomeStudio בנוי, ניתן להשיג גנוטיפים מהאשכולות בעוצמה וכתוצאה מכך נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. למרות שאפשרויות תצוגה מרובות קיימות, תצוגת ברירת המחדל, הנור-R (ערך עוצמת מנורמל) לעומת הנור-תטא (יחס עוצמת allelic), היא לעתים קרובות את העלילה הכי הקלה להבדיל שלושה אשכולות נפרדים. רוב SNPs צריך להראות אחד, שניים, או שלושה אשכולות, בהתאם לתדירות אלל הקטין. שלושה האשכולות מייצגים דגימות הוכחת AA, AB, או אללים BB (ראה איור 7). אשכולות אלה ניתן להקצות גנוטיפים או על ידי יבוא תבנית עמדת קיבוץ באשכולות סטנדרטית ישירות מהחברה, על ידי בחירה &quot;מקבץ את כל SNPs&quot; מסרגל כלי ניתוח של התוכנה, או על ידי לחיצה וגרירה של העיגולים הצבעוניים על מגרשי עוצמתו של אדי ידני<html> לא קורא. הצבע של המדגם על המגרש העצמה (אדום, סגול או כחול) מציין את השיחה (AA, AB, או BB, בהתאמה); שחור מציין שאין שיחה. על ידי דפדוף בSNPs מופיע בחלונית נתונים המלא של התוכנה, באשכולות לכל SNP ניתן לראות או נזכרו. ברגע האשכולות מוקצים שיחות משביעות רצון, חלונית הנתונים המלאה של התוכנה מפרטת את גנוטיפים עבור כל דגימה בודדת בכל SNP מסוים. האפשרות לבחירת העמודות שמעל לטבלה יכולה לעבור פורמטי נתונים. הנתונים ניתן לייצא או דרך סרגל הכלים של ניתוח או ישירות מטבלת נתונים המלאה לניתוח מעמיק. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. סקירה - Infinium Assay פרוטוקול.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. בסיס ומזרן, בתוספת מכסה היב הקאמרי שלמים. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> איור 3 טוען Beadchip -.. לוותר על המדגם ביציאות המפרצון [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה גדולה יותר</a><html> תמונה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> איור 4 הסרת Coverseal Beadchip -.. אחוז בחותם בפינה ולקלף בעדינות באלכסון [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> איור 5. עצרת Beadchip זרימה דרך שלמה - BeadChip מופרד משקופיות זכוכית עם spacer וקשר עם אבזמים.<html> &gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> איור 6. BeadChip סריקה מוצלחת -) BeadChip נסרק עם שני לייזר אדום וירוק; מציג תוכנת סריקה הן בו זמנית. סעיפים שעוברים QC עוצמת ידגישו ירוקים בתצוגת BeadChip לשמאל. סעיפים שלא הצליחו QC עוצמת ידגישו אדומים בתצוגת BeadChip. ב &#39;) לאחר שהסריקה הושלמה, התוכנה כיסוי מציגה האדום וירוק. תמונה מוגדלת ב מוצגת. הצבע והעוצמה של כל חרוז בודד מציין את הווה אלל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> דק page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> איור 7. SNP NORM-R לעומת NORM תטא פרופילי Cluster -) SNP חוקי עם שלושה אשכולות נפרדים המייצגים את AA, AB, וגנוטיפים BB, בצבע אדום, סגולה, כחולה וארוחת בוקר) עריכה דורשת SNP.. האשכול באמצע, שאמורה להיות AB הומוזיגוטים, נותר בלתי נקרא. אשכול BB נקרא בטעות AB. C) SNP ביצועים ירוד. ניתן להשיג לא גנוטיפים מעלילה בעוצמה זו, שכן אין אשכולות שונים קיימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications at JoVE.com

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

פרוטוקול מתואר המשתמש במבחני Infinium של Illumina לבצע גנוטיפ בקנה מידה גדולה. מבחני אלה יכולים אמין גנוטיפ מיליונים SNPs על פני מאות דגימות DNA בודדות בשלושה ימים. נוצר פעם אחת, יכולים לשמש גנוטיפים הבאים כדי לבדוק לעמותות עם מגוון רחב של מחלות או פנוטיפים שונים.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

infinium-assay-for-large-scale-snp-genotyping-applications

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Genomes and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

38.6K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation.  פרוטוקול מתואר המשתמש במבחני Infinium של Illumina לבצע גנוטיפ בקנה מידה גדולה. מבחני אלה יכולים אמין גנוטיפ מיליונים SNPs על פני מאות דגימות DNA בודדות בשלושה ימים. נוצר פעם אחת, יכולים לשמש גנוטיפים הבאים כדי לבדוק לעמותות עם מגוון רחב של מחלות או פנו...

Video: Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

הכנה בקנה מידה גדול של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי על ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...