תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים נחוצה ביותר לאיסוף כמות עצומה של נתוני קריו לאפיון מבני של מקרומולכו ללא. חבילת תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים שימשה כאן כדי לאפיין את המבנה של מקרומולקולות ביולוגיות שונות, הקשורות ישירות לביולוגיה של פתוגן. לדוגמה, מיקובקטריום, HIV ו- SASCO 2.
ראשית, הפעל את תוכנת רכישת נתונים אוטומטית של Latitude-S על-ידי לחיצה על DigitalMicrograph מתפריט ההתחלה. לאחר מכן, בחר את מנהל הטכניקות ולאחר מכן את סמל Latitude-S עבור איסוף נתונים אוטומטי של חלקיק יחיד. כדי ליצור הפעלה המבוססת על הגדרות ההפעלה הקודמות, סמן את תיבת הסימון בהתבסס על הפעלה קודמת בלוח הצבעים ולאחר מכן בחר בלחצן החדש או כדי להמשיך בהפעלה קיימת, לחץ על לחצן המשך.
כדי להתחיל הפעלה חדשה לחלוטין, לחץ על הכרטיסיה החדשה בלוח הצבעים. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה להמשך ובחר את התיקיה לשמירת הנתונים. לאחר מכן, לחץ על סמל ההגדרה ובתיבה סייר במצב מנוהל שמופיעה, הוסף מצב, הגדר את תנאי TEM, תנאי המצלמה ואפשרות תמונה או מלאי.
לאחר מכן, תן שם למצב או פתח את סיכום הגדרת המצב כדי לפתוח את הגדרות השמירה. לאחר מכן, קבע את תצורת מצב האטלס על-ידי לחיצה על לוח המצב אטלס והגדר את הפרמטרים להגדלה, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא. לאחר מכן קבע את תצורת מצב הרשת על-ידי לחיצה על לוח מצב הרשת, הגדר את הפרמטרים עבור אופטיקה הדמיית מיקרוסקופ, תנאי תאורה וזמן חשיפה למצלמה, ולחץ על הבא.
קבע את תצורת מצב החור על ידי לחיצה על לוח החורים והגדר את אופטיקת ההדמיה, תנאי התאורה, הפרמטרים של binning וזמן החשיפה למצלמה. לאחר לחיצה על הבא, להגדיר את מצב המיקוד הבא על ידי לחיצה על לוח המוקד ולהגדיר את הגדרות המיקרוסקופ עבור אופטיקה הדמיה, תנאי תאורה, binning וזמן חשיפה למצלמה. לאחר מכן התמקדו באזור הפחמן האמורפי ליד החור ולחצו על הבא כדי לעבור למצב הבא.
קבע את תצורת מצב הנתונים על-ידי לחיצה על לוח הנתונים והגדר את הפרמטרים עבור הגדרות מיקרוסקופ ולאחר מכן לחץ על הבא. לחץ על לוח התצורה של המוקד המציין את טווח ערכי ההשבתה ואת גודל השלב בכרטיסיה הנתונה ולחץ על הלחצן הבא כדי לעבור לשלב הבא. התמקד בתכונות הנדרשות ברשת ולחץ על לחצן הלכידה.
לאחר מכן מקם את סימן הצלב האדום על אותה תכונה בכל תמונה של מצבים שונים. התחל עם מצבי מיקוד, נתונים וחורים, מכיוון שתחום הראייה גדול יותר מהמדינות אטלס ורשת. לאחר מכן, הגדל את מצבי אטלס ורשת כדי למקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה.
כדי לחשב את המיקומים וההיסט בין כל אחד מחמישה מצבים שונים ולשקף את המיקום וההיסט לחלון הפלט, לחץ על לחצן חשב. לחץ על לוח לכידה ובחר את גודל האטלס כדי לכסות את הרשת כולה או חלק מהרשת בהתבסס על הדרישה. כדי ללכוד את האטלס, נווט על האטלס ובחר את ריבוע הרשת בהתבסס על עובי הקרח.
לאחר בחירת ריבועי הרשת הרצויים, לחץ על לחצן לוח הזמנים וצפה באריחים בריבוע הרשת מתמלאים כאשר כל ריבוע רשת נלכד. לאחר לחיצה על לחצן לוח הזמנים, בחר חור מייצג בריבוע הרשת על-ידי הוספת מיקום החור. לאחר רכישת תמונת החור, הגדר את הנתונים ואת מיקומי המוקד ושמור את הפריסה כתבנית.
לחץ על חיפוש אוטומטי, הזן את גודל החור, ולחץ על כפתור למצוא בתוכנית כדי למצוא באופן אוטומטי את החורים המבוססים על הקוטר. הגדר את העוצמה כדי להסיר את החורים מכיכר הרשת וזיהום הקרח. ולאחר הוספת כלי הסימון הנבחרים והצהובים באמצעות חיפוש אוטומטי, לחץ על לחצן לוח הזמנים במשימות קו רוחב.
לפי ההקרנה הידנית הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה באמצעות תוכנת cisTEM, רוב הנתונים נמצאו בטווח האותות הרצוי. בנוסף, תמונות שנאספו בטווחי נטרול, נבדקו גם באופן ידני על ידי cisTEM. חלקיקי ספייק נבחרו באופן ידני כדי לחשב את ממוצעי המחלקה הדו-ממד להדמיה מבנית, מה שהציע בחום, אך אפיון מבני ברזולוציה גבוהה היה אפשרי באמצעות ערכת הנתונים המתאימה.
הסיווג 3D ציין כי חלבון ספייק יש 1RBD באישור פתוח למעלה וכל RBD אחרים באישור סגירה למטה. האישורים הפתוחים של 1RBD של חלבון ספייק שוחזרו באמצעות סימטריה C1. מפת חלבון ספייק מיוצגת בתצוגה הצדדית העליונה והתחתון.
ומפת ה-EM מצוידת במבנה אטומי להדמיה טובה יותר של שרשראות הצד. אישורי הסגירה של RBD היו מעודנים עם סימטריה C3 ודגם מזוקק תלת-ממדי ספייק ומפת EM, מצויד במבנה אטומי כפי שמוצג. ואישור ביניים של חלבון ספייק שזוהה כתחמת המשנה S2 הצביע על שרשראות הצד של שאריות חומצות אמינו בודדות.
התוצאות הראו כי Latitude-S יכול לאסוף נתוני CRYO EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. תוכנה אוטומטית זו לאיסוף נתונים יכולה לשמש לכל מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים אחרת לאיסוף נתונים באופן אוטומטי.
