ניתוח קריו-EM של חלקיק יחיד הפך לטכניקה שגרתית בארגז הכלים של הביולוג המבני החל על מגוון רחב של דגימות כולל חלבונים ממברנה, סיבי עמילואיד, חלבונים מחייבים חומצת גרעין ווירוסים. לאחר השלמת הכנת המדגם והרשתות נטענות למיקרוסקופ, איסוף הנתונים יכול להתבצע מרחוק במתקני cryo-EM רבים כגון המעבדה לביו-מבנה Astbury ו- eBIC. חסמים עיקריים לקביעת מבנה מוצלחת טמונים לעתים קרובות בשלבי הכנת המדגם וסינון הרשת עם איטרציות מרובות הנדרשות לעיתים בתהליך זה.
כאן, אנו נודגים סינון רשת מרחוק ורכישת נתונים של חלקיק יחיד. בכרטיסיה טעינה אוטומטית של ממשק המשתמש של המיקרוסקופ, תחוץ את תיבת הדו-שיח אפשרויות באמצעות החץ ולחצה על לחצן המלאי. פעולה זו תבדוק ברצף כל מיקום בקלטת כדי לקבוע אם קיימת מחסנית.
המלאי יפעל על כל חריץ ברצף. כאשר כל החריצים הכבושים ממופים, המלאי ייפסק. סמן את הרשת שיש להעביר לעמודת המיקרוסקופ ולחץ על טעינה.
תווית החריץ תהפוך מכחול לצהוב לאחר שרשת הטעינה בהצלחה על הבמה. כדי לסנן את הרשתות, פתח את תוכנת EPU. בדף ההכנה, בחר אופטיקה והגדרות רכישה ולאחר מכן בחר את הקביעה המוגדרת מראש של אטלס מהתפריט הנפתח.
בחרו קביעות קרן מוגדרות מראש מתאימות ולחצו על ערכת הדחיפה של הפרמטרים למיקרוסקופ. לחץ כדי לפתוח שסתומי עמודה ולהכניס את מסך שפעת. בדוק כי קרן גלויה ומופצת מספיק ומרוכזת כדי לכסות את הגלאי.
במידת הצורך, נווטו לאזור דק יותר ברשת באמצעות הג'ויסטיק או לוחות היד הווירטואליים כדי לשלוט בתנועות הבמה ב- X וב- Y.Lift את מסך השפעת ולצלם תמונה באמצעות לחצן התצוגה המקדימה ב- EPU. ב- EPU, עבור לדף האטלס ולחץ על הפעלה חדשה. בחר את תבנית התמונה MRC והזן שם תיקיה ומיקום מתאימים לשמירת הפעלת ההקרנה ולאחר מכן לחץ על החל.
בחר הקרנה מהתפריט מימין. סמן את תיבות הסימון לצד כל רשת כדי שנרכש מונטאז' אטלס ולאחר מכן התחל את הפעלת ההקרנה ב- EPU. אטלס נרכש עבור כל רשת מסומנת לריבועי רשת זמינים מפורטים עם השלמתם.
ניתן לצפות בכל אטלס על-ידי הדגשתו בדף ההקרנה. בסיום, סקור את האטלסים שנאספו וזיהה את הרשתות המתאימות להערכת איכות המדגם בהגדלות גבוהות יותר. סמן את הרשת שנבחרה בתפריט ההקרנה EPU ולחץ על דוגמה לטעינה.
מתפריט ההקרנה אטלס, בחר את הרשת שנטענה כעת והזז את הבמה לריבוע רשת המכיל את החורים המלאים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום הרצוי בתמונת הרשת ובחירת שלב המעבר כאן. חזרו לעמוד ההכנה ל-EPU ובחרו את הקביעה המוגדרת מראש של הרשת. פתחו את עמוד הפונקציות האוטומטיות של EPU והפעילו את ההטיה האוטומטית-אוצנטרית לפי שלב עם הקביעה המוגדרת מראש של ריבוע הרשת כדי להעביר את הדגימה לגובה האוצנטרי.
בהכנה ל-EPU, צפו תמונת תצוגה מקדימה מרובעת חדשה של הרשת. שים לב לערכים האפורים על פני חורים שונים המציינים עובי קרח שונה. הזז את השלב מעל חור באמצעות לחץ באמצעות לחיצה ימנית והזז את השלב כאן.
בחרו את החור או את קביעת הגובה האוצנטרית המוגדרת מראש ולחצו על תצוגה מקדימה. בחר קביעה מוגדרת מראש של רכישת נתונים והגדר הגדלה המאפשרת זיהוי קל של החלקיקים. הגדר את היסט ההיסט ל- מינוס 3 עד 5 מיקרומטר.
יש לחזור על שלבים כדי להעריך מחדש טווח של עובי קרח עבור התפלגות חלקיקים, כיוון וזיהום על-פני הרשת. בהתאם לזמינות המיקרוסקופ, המשך ישירות לאיסוף נתונים או שניתן להסיר רשתות מהמיקרוסקופ לצורך איסוף עתידי, כולל באתרים אחרים. לאסוף אטלס אם אחד אינו זמין מהקרנה על ידי הגדרת הגדרות אטלס ובחירת רשת לרכוש אטלס.
לרכוש אטלס ולחץ על מיקום הרשת כדי לראות את הפלט. לאחר השלמת האטלס, הגדר כל אחת מההגדרות המוגדרות מראש של הקרן בהתאם לצרכים הניסיוניים של הפרויקט. בצע כיול הזזת תמונה.
הגדר את הפעלת ה-EPU על-ידי בחירת הגדרת הפעלת עמוד EPU ולאחר מכן בחירת הפעלה חדשה או חדשה מהעדפות. לאחר בחירת הפעלה חדשה, יופיע מוקפץ המספק אפשרות להשתמש בהגדרות קודמות. ההגדרות ייטענו באופן אוטומטי מההפעלה הקודמת להפעלה הנוכחית של EPU.
לחלופין, בחרו 'חדש' מהעדפות ובחרו קובץ עם העדפות שמורות כדי לטעון מראש מידע זה ל-EPU הנוכחי. מלא את שם ההפעלה במשהו אינפורמטיבי. בסוג, בחר ידני.
עבור מצב רכישה, בחר ריכוז חורים מדויק או רכישה מהירה יותר אם אוסף הסטייה החופשי של העברת התמונה זמין ורצוי. בחר את תבנית התמונה הרצויה ולאחר מכן בחר תיקיית אחסון ו- EPU ייצור ספריה בשם ההפעלה. בחר את הרשת המתאימה לפיה נעשה שימוש בריווח חורי רשת והקש על החלה.
בחר ריבוע רשת התחלתי והגדר תבנית רכישה. עבור אל בחירה מרובעת. אם כל הריבועים ירוקים, לחץ על בטל את הבחירה בכל הימני העליון.
פתח אריחים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן בחירה באריחים פתוחים. הוסף או בחר ריבוע רשת על-ידי לחיצה על Select ולאחר מכן לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחירה באפשרות העבר שלב לריבוע רשת. עבור אל בחירת חור ולחץ על אוטומטי eucentric.
המתן עד לתמונה מרובעת של רשת. אם הפונקציה האוטומטית נכשלת, ייתכן שהסיכום לכך הוא שהגובה כבוי באופן משמעותי. ניתן לכוונן אותו באופן ידני באמצעות מסך השפעת בהגדלה מרובעת של הרשת.
כדי למדוד את גודל החור, הזז ולהתאים את העיגולים הצהובים כך שהם מעל החורים עם גודל ומרווח נכונים. לחץ למצוא חורים. בדוק כי החורים נמצאו כראוי.
אם לא, שנה את גודל החור ולחץ על מצא חורים שוב. אם תהליך זה נכשל בעקביות, שקול לעבור למספר נמוך יותר או לגודל נקודה בהיר יותר בהגדלה מרובעת של רשת. השתמש בהיסטוגרמה של איכות הקרח של המסנן בצד ימין כדי להתאים את בחירת החורים.
זה יכול להיות שימושי כדי לא לכלול אזורים עם קרח עבה וקרח דק. אפשרות זו תיזכר עבור ריבועי רשת עתידיים שנבחרו במהלך ההפעלה. מטב את בחירת החורים בעזרת הכלים בתפריט הנבחר בחלק העליון.
לדוגמה, לחץ על הסר חורים קרוב לסרגל הרשת. עבור להגדרת תבנית ולחץ על acquire. לחץ על חיפוש ומרכז חור.
שנה את ההשהיה לאחר הסטת השלב והשהה לאחר זמני הזזת התמונה לשניה עד חמש שניות, ולאחר מכן, בדוק שערך הסטת התמונה המרבי הוא לפי הרצות. לחץ על הוסף אזור רכישה ולחץ במקום כלשהו בתמונה. העבר את אזור הרכישה למיקום הרצוי.
הוסף את טווח ההשבתה בצד ימין למעלה. רשימת נטרול טיפוסית לפרויקט חלבון ממברנה היא מינוס 0.8 למינוס 0.8 למינוס שלושה מיקרומטרים, ואז מוסיפים אזורי רכישה אחרים, ומסדרים אותם כך שתחומי הרכישה לא ייחשפו כפליים עם הקרן. לחץ על הוסף אזור מיקוד אוטומטי ולחץ במקום כלשהו בתמונה.
העבר את אזור המיקוד האוטומטי לפחמן המקיף חור. הנוהג המקובל הוא להתמקד אוטומטית לאחר ריכוז בעת שימוש ב- AFIS או כל חמישה עד 15 מיקרומטר בהתאם לשינוי גובה Z על פני הריבוע. לחץ על הוסף אזור מדידת דריפט.
מדידת דריפט שבוצעה פעם אחת בריבוע רשת עם סף מוגדר של 0.05 ננומטר לשנייה כהגדרה סטנדרטית. אזור מדידת הסחף יכול לחפוף ישירות לאזור המיקוד האוטומטי. ודא שלא סחיפה ולא אזור מיקוד אוטומטי חופפים לאזור רכישה.
חזור לבחירה מרובעת ובחר את הריבועים לרכישה ברשת. השתמש במספר אזורי הרכישה ובקצב רכישת הנתונים הצפוי כדי לחזות כמה אזורי רכישה נדרשים. כאשר כל הריבועים הרצויים נבחרים, לחץ על הכן את כל הריבועים.
לאחר איסוף כל ריבוע, נווטו בין ריבועי הרשת והתכוונן היטב את החורים באמצעות מברשת הבחירה. עבור למיקום שלב מעל הדגימה והשתמש בפונקציות אוטומטיות כדי להגדיר גובה אוצנטרי. בצע יישור מיקרוסקופ באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כמתואר קודם לכן ובטקסט.
בצע יישור ללא תרדמת בתוך הפונקציות האוטומטיות לפני כניסה מחדש וריפרוך הצמצם האובייקטיבי ותיקון אסטיגמציה העדשה האובייקטיבית עם EPU. ודא ששני היישורים מתכנסים לערכים מתאימים. לפני תחילת ריצת הרכישה האוטומטית, ודאו כי משאבת הטורבו האוטומטית כבויה והצמצם האובייקטיבי מוכנס במידת הצורך.
ברכישה אוטומטית, לחץ על התחל לפעול כדי להתחיל ברכישת נתונים אוטומטית. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לסנן ולהשליך רשתות שבורות או יבשות בשלב האטלס. שיפוע קרח נצפה על פני רוב הרשתות.
במהלך ההקרנה, התפלגות חלקיקים אידיאלית היא monodispersed עם מגוון של כיווני חלקיקים גלויים. אם הקרח דק מדי, הוא יכול להינמס כאשר הוא מואר בקרן האלקטרונים, מה שגורם לתנועה מוגזמת במיקרוגרף. זה הוא הנפוץ ביותר כאשר יש חומר ניקוי במאגר.
הקרח צריך להיות שפל כך שאזורים ברשת שבהם רוב התמונות מראות שקרח גבישי לא נכללו. סיכום גרפי של הנתונים נכלל כדי להעריך את איכות המיקרוגרף ולהחליט אם נדרשים תיקוני איסוף נתונים. בוררי חלקיקים כגון crYOLO פועלים מספיק טוב עבור מעבר ראשון של הנתונים, ומאפשרים התקדמות לממוצע מחלקה דו-יומית.
מחלקות המציגות פרטי מבנה משניים יש לבחור עבור ניתוח תלת-ממדי בעוד חלקיקי זבל יש להשליך. ניתן להשתמש בתת-קבוצה של חלקיקים כדי ליצור מודל ראשוני לסיווג ועידון תלת-ממדיים. במקרה של RagAB, ערכת הנתונים הכילה שלושה קונפורמרים נפרדים שניתן להפריד במהלך סיווג תלת-ממדי.
חשוב לזכור כי הצלחה בשלבי רכישת הנתונים וניתוח התמונה הבאים מסתמכים על השגת וזיהוי רשתות ממוטבות היטב בשלב ההקרנה. לאחר קבלת מפת צפיפות EM תלת-ממדית, ניתן לפרש אותה עוד יותר באמצעות התאמה וזיקוק של מודל חלבון או בניית מודל אטומי דה נובו. ניתוח חלקיקים יחידים Cryo-EM מאפשר קביעה מובנית של מטרות רבות שלא היו אפשריות בעבר.
ראוי לציין, זרימות עבודה אלה שימשו לאחרונה כדי לפתור מבנים של מקרו-19 הקשורים ל- COVID-19.
