פרוטוקול זה משלים להדמיית in vivo. זה מאפשר כימות סוג התא ורמת התא של רדיוטרצרים, שהוא קנה מידה שונה מזה המתקבל in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרגישות שלה ואת הרזולוציה התאית שניתנה על ידי שימוש רדיוליגנדים ומיון התאים.
הפעל את המצלמה וטען את תוכנת ההפעלה. לחץ על כפתור הבמה Home XYZ כדי לבצע ביות. הגדר את הניסוי המורכב מרכישת סריקה אחת של 10 דקות.
הגדר את מצב הצעד לקנס ואת מצב הרכישה ל- Listmode כדי לרשום את כל ספקטרום הפליטה. הגדירו את המיטה וודאו שמערכת החימום, חיישן הנשימה והרדמה מתפקדים ובטוחים. לאחר מכן, הניחו פנטום שבו יוצב ראש החיה.
הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים עבור שלושת הממדים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך. ודא שנפח הסריקה של הפנטום והחיה זהה. התחל את סריקת הפנטום לכיול הבא עם הפרמטרים שנקבעו בעבר.
הקפידו לעבוד בסביבה מתאימה, המאושרת לניסויים המערבים רדיואקטיביות. דגירה של 100 מיקרוגרם של מבשר טריבוטילין ב-100 מיקרוליטרים של חומצה אצטית עם נתרן יודיד וחמישה מיקרוליטרים של 37% חומצה פרקטית ב-70 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתרמוציפלר המוצב בתא כפפות. דיללו את התגובה באמצעות 50% אצטוניטריל במים כדי להגיע לנפח של 500 מיקרוליטרים.
הזריקו את 500 המיקרוליטרים של התגובה המדוללת לעמודה בעלת פאזה הפוכה. בודד את ה-CLINDE עם HPLC בעל שיפוע ליניארי הפועל מ-5 עד 95% ACN בחומצה זרחתית שבעה מילימולרים למשך 10 דקות. דיללו את הבידוד במים כדי להגיע לנפח סופי של 10 מיליליטרים ואז הזריקו את התגובה המדוללת לעמודת ריכוז.
הורידו את ה-CLINDE מהעמודה עם 300 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט ואז התאדו את האתנול על ידי דגירה שלו בצנטריפוגת ואקום בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. דיללו את השאריות המכילות את ה-CLINDE ב-300 מיקרוליטרים של מלחים כדי ליצור תמיסת מלאי. לאחר מדידת הרדיואקטיביות שלו, דיללו את תמיסת המלאי במי מלח כדי לקבל פתרון של 0.037 מגה-באקרל ב-500 מיקרוליטרים.
קבעו את עקומות הכיול עם תרכובות ייחוס קרות ופתרו את משוואת הרגרסיה הליניארית:Y שווה ל-AX פלוס B כדי לקבל מקדמי A ו-B. X מייצג את המסה של תרכובת הקור, ו-Y מייצג את השטח שמתחת לעקומות. בדוק את האזור שמתחת לעקומת הרדיוליגנד, מדידת ספיגה אולטרה סגולה ב-450 ננומטר בהתבסס על עקומת הכיול והאזור שמתחת לעקומת הרדיוליגנד.
להעריך את המסה ולמדוד את הפעילות של radioligand. ודא שהפעילות הספציפית גדולה מ-1, 000 ג'יגה-באקרל לכל מיקרומול. לחץ על הלחצן עדכן תמונה כדי לעדכן את מיקום החיה.
הגדר את אזור הסריקה על-ידי החלקת הסמנים בעזרת שלוש התמונות בחלק התחתון של המסך עבור שלושת הממדים. הגדר את הניסוי בסריקה של 60 דקות המהווה 60 פריימים של דקה אחת. השתמש שוב בכל הפרמטרים האחרים שהוגדרו בתחילה.
להזריק 500 microliters של radiotracer רדיואקטיבי ולאחר מכן לשטוף את הצינור עם 300 microliters של סטרילי 0.9% נתרן כלורי. במקביל, לחץ על התחל רכישה כדי להתחיל את הסריקה. פתח את תוכנת שחזור הסריקה ולאחר מכן פתח את מערך הנתונים, חפש את קובץ הפרמטרים של שם הקובץ שנוצר בתיקייה של הסריקה.
בחר את האיזוטופ של העניין. שים לב שפרמטר מצב הרשימה מאפשר בחירת איזוטופים מרובים בשלב זה. הגדר את פרמטרי השחזור השונים כגון גודל הווקסל, מספר תת-הקבוצות ואיטרציות כמתואר בכתב היד.
בחר את פורמט הפלט כ- NIFTI ולאחר מכן בחר התחל שחזור SPECT. השתמש במרית מתכת שטוחה ובסכין גילוח כדי לנתח את אזורי העניין של המוח. מניחים את הרקמות בצינור צנטריפוגה של שני מיליליטרים ושוקלים את הרקמה המתקבלת.
מכניסים את הדגימות לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטרים עם מיליליטר אחד של HBSS ללא סידן ומגנזיום ולאחר מכן צנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ומסירים את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורית. הוסיפו 1, 900 מיקרוליטרים של תערובת אנזים אחד ודגירו אותו למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי התססת הצינורות על ידי היפוך כל חמש דקות. הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שתיים.
התסיסו בעדינות עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר הלוך ושוב 30 פעמים. לאחר מכן, דגירו את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי תסיסה של הצינורות על ידי היפוך כל חמש דקות. מערבבים בעדינות קדימה ואחורה עם פיפטה של 200 מיקרוליטר ולאחר מכן פיפטה של 10 מיקרוליטר לפני דוגרים את התערובת במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את הרקמות.
סנן את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר והוסף 10 מיליליטרים של HBSS ללא סידן ומגנזיום. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור. לצורך הידלדלות המיאלין, יש לבצע החייאה של הכדור עם 400 מיקרוליטרים של חיץ להסרת מיאלין ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטרים של חרוזי הסרת מיאלין לפני הדגירה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הוסיפו חמישה מיליליטרים של מאגר להסרת מיאלין וצנטריפוגה 300 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר להסרת מיאלין והניחו את הכדורים התלויים בעמודת השדה המגנטי. שטפו את העמוד עם מיליליטר אחד של מאגר להסרת מיאלין ארבע פעמים.
צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור. מערבולת לזמן קצר כדי לנתק את התאים ולהוסיף חמישה מיקרוליטרים של Fc Block CD32. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים ראשוניים בעלי עניין ודגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור. מכתימים את הצינורות במהופך על נייר רך. סובבו את הצינור לזמן קצר, ואז הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת הנוגדנים המשנית ודגרו במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הוסף מיליליטר אחד של חיץ להסרת מיאלין וחזור על הצנטריפוגה. השליכו את ה-supernatant והכתימו את הצינורות במהופך על נייר רך. בצעו שימוש חוזר בתאים ב-250 מיקרוליטרים של PBS סטרילי והמשיכו ישירות למיון תאים.
סריקת IN VIVO SPECT של חולדות מסוג בר הראתה קשירת CLINDE גבוהה יותר באתר של הזרקת הליפופליסכריד מאשר באזור הקונטרה-לרוחבי של המוח. דגימות ה-ex vivo שעברו מיון תאים פלואורסצנטי המופעל על ידי רקמות רדיוליגנד, או FACS-RTT, חשפו נוכחות של מספר גבוה יותר של אתרי קישור CLINDE רק במיקרוגליה, והראו כי המקור התאי של אות ה-CLINDE בצד האיפסילטרלי של המוח היה מיקרוגליה. העלייה בחלבון טרנסלוקטור, או קשירת TSPO, בגיל 12 חודשים בחולדות TgF344-AD הוגבלה לאסטרוציטים.
בחולדות בנות 24 חודשים נצפתה העלייה בקשירת TSPO עקב שינויים אסטרוציטיים ומיקרוגליאליים כאחד. בחולדות TgF344-AD ישנות יותר, אסטרוציטים סטריאליים הראו ירידה בצפיפות 5HT2AR בהשוואה לסוג הבר. ביטוי יתר בקליפת המוח של TSPO נצפה הן באסטרוציטים והן במיקרוגליה של נבדקי AD בהשוואה לבקרות תואמות גיל כאשר FACS-RTT בוצע על דגימות AD אנושיות לאחר המוות.
בעת עבודה עם רדיואקטיביות, בצע את ההוראות של הגנת רדיו וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. לאחר מכן, לאחר ההליך, הקפד לנטרל את סביבת העבודה. כימות חלבונים וניתוח ביטוי גנים יכולים להיעשות בקלות לאחר הליך זה על אוכלוסיות תאים מבודדים.
