פרוטוקול זה מציג את המתודולוגיה המתאימה לחיתוך והכתמה של רקמת הלב והמוח. הוא גם מספק קווים מנחים להקמת תצורות תאורה ומצלמה וטכניקות צילום לרכישת תמונה. שיטות אלה שימושיות במיוחד לביצוע מדידות בניתוח פלנימטרי תמונה ברקמות מכרסמים, ויכולות להיות בעלות ערך למקרופאוטוגרפיה מדעית כללית.
בתור התחלה, נתק את צינורית הלב מהמזרק המלא בתמיסת קרבס-הנסליט ומחובר למזרק מלא בתמיסת קרבס-הנסטלייט חמה המכילה 0.1% מתילן כחול. יש לעיין בלב החולדה עם ארבעה מיליליטרים של תמיסת מתילן כחולה בקצב של ארבעה מיליליטר לדקה. לאחר ניתוק הצינורית מהמזרק והסרת הלב מהצינורית, הסר את עודף המתילן הכחול על ידי גלגול עדין של הלב על נייר טישו.
לאחר הסרת עודף מתילן כחול, לשחרר את הקשירה סביב העורק הכלילי על ידי פתיחת מלקחיים hemostatic והסרת צינורות פלסטיק סביב התפר כירורגי. לאחר מכן, מניחים את לב החולדה המוכתם במטריצת נירוסטה לחיתוך. חותכים את החדרים לפרוסות בעובי שני מילימטר, מכוונים לשש עד שבע פרוסות מלב עכברוש בוגר אחד.
לאחר החיתוך, מעבירים את הפרוסות לצינור פלסטיק של 15 מיליליטר. לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיליליטר של 1% טריפניל טטרזוליום כלוריד מומס PBS לצינור עם פרוסות הלב ודגר במשך 10 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין לאחר חמש דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את פרוסות הלב לפחות פעמיים עד שלוש פעמים עם PBS ולהתכונן ללכידת תמונה.
לאחר הסרת המוח, כולל גזע המוח, מהגולגולת, מניחים את המוח עם הצד הגחוני שלו למעלה במטריצת המוח. בהתאם למשקל של בעלי החיים, לבחור את הגודל הנכון של מטריצת נירוסטה במוח. באמצעות להבים, להגביל את החלקים הקדמיים caudal של המוח.
לאחר מכן, לשים את הלהבים חלקית לתוך הערוצים בין הלהבים הראשון והאחרון. כאשר כל הלהבים מוכנסים ומסודרים במקביל, לחץ על כל הלהבים למטה עם כף היד בו זמנית כדי לחתוך את המוח לפרוסות קורונל שני מילימטר. לאחר מכן, לתפוס את הלהבים בחוזקה לאורך הצדדים עם שתי אצבעות ולהסיר אותם יחד עם המוח פרוס מן המטריצה.
מסדרים את פרוסות המוח בזה אחר זה במגש, ומבטיחים שהמשטח הפנימי של כל פרוסה תמיד פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, לשפוך חם 1% טריפניל tetrazolium כלוריד פתרון PBS על פרוסות המוח ודגר במשך שמונה דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, העבירו את פרוסות המוח למגש פלסטיק כחול כדי לצלם תמונות.
מסדרים את פרוסות המוח בסדר רציף מהחלק הקדמי לחלק הקודלי ומשתמשים באזמל כדי להפריד את ההמיספרות במישור הקשת. צלם את פרוסות הרקמה מיד לאחר ההכתמה. הגדר את המצלמה לפי בחירה באמצעות סוללה טעונה, כרטיס זיכרון ועדשה מחוברת במעמד.
בהתאם למקורות האור הזמינים, בחר את הגדרות האיזון הלבן המתאימות או בצע כיול טמפרטורת צבע בהתאם להוראות במדריך המצלמה. יש לטבול את פרוסות הלב לחלוטין במיכל עם PBS. מסדרים את פרוסות המוח במגש יבש ללא PBS או נוזלים אחרים.
מקם את הגורם המכיל עם פרוסות מתחת למצלמה עם עדשת המאקרו. ודא שכל הפרוסות מתאימות באופן מלא לשדה הראייה ונמצאות באותו מישור. העבר את המצלמה למצב ידני מלא, הגדר את ISO 100 וצמצם ל- F10.
התאימו את מהירות התריס לחשיפה אופטימלית לתמונה וודאו שמישור מוקד המצלמה מקביל לפני השטח שבהם נמצאת המדגם. לאחר לכידת מספר הדגימה, סובבו את מסנן הקיטוב המעגלי עד להעלמת ההשתקפויות, ודמיינו את פרוסת הרקמה באמצעות הדק מרוחק כדי למנוע ניעור מצלמה בעת שחרור התריס, ולאחר מכן סובבו את הפרוסות ולכוד תמונות מהצד השני. תמונה זו של מתילן כחול טריפניל טטרזוליום כלוריד מוכתם פרוסת לב לאחר אוטם שריר הלב מכיל מספיק פרטים ומידע צבע לניתוח פלנימטרי נוסף של גודל אוטם.
הקפאת רקמת הלב למשך 24 שעות משפיעה על השלמות ומפחיתה את תפקוד המיטוכונדריה. לכן, טריפניל טטרזוליום כלוריד כתמים של הלב אינו אדום אבל ורוד חיוור, ואת הגבול בין רקמות נמק קיימא מטושטש. מתוך שתי השיטות בהשוואה להפחתת השתקפויות בדגימות, טבילה היא השיטה היעילה ביותר ומייצרת תמונות מפורטות עם ניגודיות טובה.
מסנן הקיטוב יעיל גם הוא, עם זאת, הוא מפחית מעט את הרזולוציה ואת המיקרו-קונטרסט של התמונה. תמונה של פרוסת לב ללא טבילה או מסנן מכילה השתקפויות רבות ואינה מתאימה לניתוח נוסף. בניתוח הפלנימטרי, יש להשוות את הצד הלא מושפע של המוח לצד המושפע משבץ.
הגדרות מצלמה ידניות מבטיחות חשיפה אופטימלית ואיזון לבן של כל התמונות, ומאפשרות ניתוח אחיד. דוגמאות לתמונות חשופות יתר על המידה ולא חשופות של פרוסות לב מוצגות כאן. יתר על כן, הגדרות איזון לבן שגויות גורמות למעבר לכחול או צהוב ומגנטה או יציקה ירוקה בתמונה.
מקרופוטוגרפיה מדעית דורשת תאורה מבוקרת ומערך הדמיה מתאים. המתודולוגיה המתוקננת מבטיחה תמונות דיגיטליות איכותיות ומפורטות. שיטה זו חלה על כל צילום איברי בעלי חיים קטנים ניסיוניים.
