עד כה, האורגנוידים המוחיים המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם מודל 3D במבחנה הקרוב ביותר לרקמת המוח האנושית המקומית. בנוסף, אורגנוידים מוחיים מתאימים באותה מידה למידול פתולוגיות שונות של מערכת העצבים המרכזית, לבדיקת חומרים פעילים פרמקולוגית, וגם לשימוש ברפואה רגנרטיבית. בינתיים, טכנולוגיה זו עדיין נמצאת בשלב הראשוני של הפיתוח.
הפרוטוקול יכול להיות מחולק לשתי קבוצות בהתאם לשיטת קבלת אגרגטים ואת הטיפוח נוסף עם בידול. הראשון כולל פרוטוקול ומזימות של בידול, שונה בזמן הטיפוח ומעוררי בידול עם הבשלה מאוחרת יותר של organoid בשייקר במכשירים מיוחדים של הידבקות נמוכה כמו צינורות שוק או צלחות. קבוצה נוספת כוללת שימוש ביו-רה-קטרים מיוחדים.
ניתוח של פרוטוקולים שונים הראה כי organoids צריך להיות מעובד בתנאים עם מדיום מיזים במחזור. עם זאת, היעדר מערכות פשוטות וזולות להשגת organoid עם גודל סטנדרטי ומורפולוגיה דורשים פיתוח של מכשירים כאלה כדי לשנות את קנה המידה של התהליך. בעבודה זו, אנו מתארים את השיטה שלנו לקבלת ובדיקה של ביו-רהקטורים מיני פשוטים וזולים המאפשרים להשיג כמויות גדולות של organoids באיכות גבוהה.
חותכים את צינורות צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר לתוך הטבעות, 7 או 8 מילימטרים גובה. תבודד את הטבעות. לשבור אגרגציות נמוכות על מנות פטרי מטופלות או מיקרוביולוגיות לפירורים.
ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מיליליטר של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי. הפוך ידית פלסטיק במרכז של סטרילי אולטרה הידבקות נמוכה 6 ס"מ צלחת פטרי. ישנן שתי דרכים מתאימות באותה מידה.
הראשון, לשים את autoclave בטבעת פלסטיק על מרכז ולהחיל חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי לחלק הפנימי של הטבעת. השני, ללא טבעות פלסטיק טיפה חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי על מרכז צלחת פטרי. השאירו את הכלים פתוחים במשך 2 או 3 שעות במכסה המנוע של זרימה למינאר עד ליובש מוחלט.
לטפח תאי גזע pluripotent המושרה במדיום עבור תאי גזע pluripotent, עד 75 או 90% מפגש בצלחות פטרי 35 מילימטר, מצופה מראש עם מטריצה מומסת דלבקו שונה נשר מדיום, ופישר-12 בינוני. הכן תחליף בינוני A פלוס סרום. לטפח תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה במשך יום אחד במדיום עם החלפת סרום.
החלף מדיום לתאי גזע פלוריפוטנטים למדיום החלפת סרום ביום האפס של בידול. הכן A.Change את בינוני עד בינוני A ביום 2 של בידול. לטפח תאים בינוני A במשך 2 שבועות, מרענן מדיום במנות פטרי כל 2 ימים.
ביום 14, להתחיל את היווצרות של כדורי באמצעות צלחת תרבות מיוחדת 24-well המכיל כ 1, 200 microwells בכל באר. הכינו צלחת תרבית של 24 באר עם מיקרווולים. מוסיפים לכל באר 1 מיליליטר של בינוני A, צנטריפוגה לזמן קצר ב 1, 300 גרם במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד מצויד מחזיק צלחת.
שליטה מתחת למיקרוסקופ שאין בועות במיקרווולים. מכינים את ה-B. מוציאים את המדיום מצלחת הפטרי. עבור ניתוק התא, לטפל בתאים עם 1.5 מיליליטר פתרון EDTA מוכן על PBS.
שלוט בניתוק התא מתחת למיקרוסקופ. לקצור את התא לתוך צינור 15 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר מעורב דולבק ופישר מדיום בצינור לכיוון התאים.
צנטריפוגה ב-200 גרם ל-5 דקות. הסר את תאי supernatant ולהשעות מחדש ב 2 מיליליטר של B. העבר את השעיית התאים המכילים 1 מיליארד תאים לתוך כל באר של צלחת 24 באר עם microwells. בעדינות pipette תאים עד ומטה מספר פעמים צנטריפוגה לזמן קצר 100 גרם במשך 1 דקה כדי ללכוד תא ב microwells.
שליטה מתחת למיקרוסקופ שהתא מופץ באופן שווה במיקרווולים. לדגור את הצלחת לילה עבור צבירת תאים בפרואידים. למחרת בבוקר, יום 15, לבדוק מתחת למיקרוסקופים את איכות כדורי, שהם שקופים וחלקים אם בריאים.
בזהירות לאסוף את כדורי מכל באר לתוך צינור 15 מיליליטר, להשאיר את כדורי לזרז על ידי כוח המשיכה במשך 2 ו 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. מוסיפים לכדורואידים 2 מיליליטר של המטריצה, מופשרים ואקס טמפור על קרח. מערבבים בעדינות על ידי צנרת ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
כדי לשטוף עודף של מטריצה, להוסיף לצינור 8 מיליליטר של B.Pipette בינוני בעדינות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 100g. הסר את סופר-טבעי. מוסיפים לצינור 20 מיליליטר של B בינוני, פיפטה בעדינות, ואז לפצל את ההשעיה כדורית בין bioreactors מיני.
לאחר מכן מניחים את bioreactors מיני לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ, אשר מונע אידוי של מים וזיהום. שים את צלחת פטרי עם bioreactors מיני על שייקר מסלולית. לטפח את organoids בקצב סיבוב 70, 75 סל"ד.
ביום 16, להכין בינוני C.Transfer organoid לתוך צינור 50 מיליליטר. במשך 5 דקות, תן להם ליפול לתחתית. שאפו את הסופר-נט והוסיפו 5 מיליליטר של C.Re. הבינוני להצטרף האורגנוידים במיני bioreactors.
לטפח כדוריות בינוני C במשך 2 שבועות, מרענן את המדיום כל 2 ימים. במהלך שבועיים אלה, בחר כ -100 כדורי כל מיני bioreactors לטיפוח הבא. ביום 30, להכין בינוני D.Change טיפוח בינוני עד בינוני D, שהוא מדיום התבגרות.
רענן את המדיום כל 2 או 3 ימים במשך 3 שבועות. לאחר מכן השתמש ב- D הבינוני המומס ב- F וב- GDNF. לאחר חודש של טיפוח רצופים בינוני A ו- B, organoids מתוקננת בגודל ומורפולוגיה מתקבלים.
ככל שהוא גדל, הם צריכים לשנות את המדיום לעתים קרובות יותר, עד 4 פעמים בשבוע גם עולה. לאחר חודשיים של טיפוח, הם מגיעים לקוטר של 4 ו-5 מ"מ. ואחרי עוד חודש, 5 ו-6 מ"מ והצמיחה נעצרת.
האיור מראה את המראה של אנזים organoid, קטעים ברורים צבועים המטוקסילין ו אאוזין. ניתוח אימונוהיסטוכימי במשך חודש אחד מראה את נוכחותם של אשכולות חיוביים SOX2 של תאי אבות, כולל בתוך החלק המרכזי. בפריפריה של האורגנוידים, חלבון חומצי פרברילי גליה, חלבון הקשור למיקרוטובול 2, והידרולסה תיאזין חיובית.
תאים מרוכזים, אשר מתאים צורה בוגרת של נוירונים. במקרים מסוימים, אשכולות של לבנים על שטח נמק נוצרים בחלק המרכזי. זה מציין את המגבלה של פרוטוקול זה לקבלת organoids גדול יותר.
סביר להניח, הגורם המגביל של הצמיחה הוא קצב דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן. אמצעי התקשורת והתאים השונים של כדוריות ובדיקת המערכת שלנו עבור סוגים מסוימים של organoids. הרבה מוח ורשתית, אורגנוידים משולבים מתאי קרצינומה בכבד ותאי גזע מזנכימליים, אורגנוידים משולבים משיחות גזע מזנכימליות בפיצוץ הבירה והבחנה בין תאי גזע המטופויים לתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ואורגנואידים במעיים.
האם זה היה משתנה בהרכב הראשוני של תאים? גורמי בידול, תרבות, מטריצה בינונית, חוץ תאית, ואולי גם הרכב תערובת הגז, קצב סיבוב האסדה ופרמטרים אחרים. ניתן יהיה להשיג organoid עם אותה צורה, גודל, או מודל מורפולוגיה באיברים ורקמות שונים.
השימוש במיני ביו-קטרים המוצעים לעבודה זו.
