צוות המחקר שלנו מפתח טכנולוגיות ופרוטוקולים למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית וטומוגרפיה של קריו-אלקטרון. פיתחנו פרוטוקולים עבור רשתות TEM micropatterning כדי לכוון צמיחת תאים ומיצוב לניסויי קריו-ET. טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים משמשת לייצור מבני רזולוציה ברמת ננומטר של קומפלקסים מקרומולקולריים בתוך תאים שנשמרו במצב של לחות קפואה מקומית.
Micropatterning יכול להגדיל את התפוקה של קריו-ET של תאים שלמים, מיקרוסקופיית אלקטרונים אור קריו-מתאם, וניסויים כרסום קרן-יון ממוקד קריו. המספר וההפצה של תאים ברשתות EM הם קריטיים למחקרי קריו-ET של תאים שלמים. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה, ניתנת לשחזור וניתן להתאמה רחבה כדי לכוון את צמיחת התאים ברשתות EM באמצעות מיקרו-פאטרנינג.
החוקר צריך להיות נוח באמצעות פיפטות, פינצטה, טכניקות תרבית תאים בסיסית, ופלואורסצנטיות ומיקרוסקופים אלקטרונים שידור. בעת דפוס בפעם הראשונה, השתמש בסוג תא ידוע ובשילוב ECM ובדוק אותם על כיסויים או מנות MatTek. חברי צוות המחקר המעורבים בפיתוח פרוטוקול זה הם: ד"ר
בריאן סיברט, מר ג'וזף קים וד"ר ג'יי יאנג. כדי להתחיל, העבר את הרשתות למחזיק הכנה לרשת וזוהר לפרוק את הרשתות פחמן בצד למעלה. לאחר מכן, העבר את הרשתות עם צד הפחמן כלפי מעלה למגלשת זכוכית נקייה או כיסוי עם הפרדה של סנטימטר אחד לפחות בין הרשתות.
פיפטה 10 מיקרוליטרים של 0.05 פולי-L-ליזין על כל רשת ולדגור את הרשתות בתא לח במשך 30 דקות לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת שלוש פעמים עם 15 microliters של 0.1 HEPES טוחן ב pH 8.5. לדגור על הרשת בכל לשטוף במשך 30 שניות, ולאחר מכן להסיר את רוב הנוזל מהרשת עם pipette מבלי לתת לרשת להתייבש.
לאחר השטיפה הסופית, להשאיר כל רשת ב 15 microliters של 0.1 HEPES טוחן. לאחר מכן, הכן את פתרון PEG-SVA והחלף מיד את פתרון HEPES ברשתות עם 10 מיקרוליטרים של פתרון PEG-SVA, ולאחר מכן לדגור על הרשתות בתא לח במשך שעה אחת לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת שלוש פעמים עם 15 microliters של מים סטריליים, דגירה הרשת בכל לשטוף במשך 30 שניות.
לאחר השטיפה הסופית, להשאיר כל רשת ב 15 microliters של מים. מניחים טיפת מים מיקרוליטר אחת על מרכז כיסוי נקי חדש, ולאחר מכן להעביר בזהירות את הרשת מ 15 טיפת מים microliter טיפה על מכסה חדש עם צד הפחמן למעלה. לאחר מכן, מקם בזהירות בסטנסיל PDMS מעל הרשת שמירה על הרשת ממורכזת ומזעור מגע סטנסיל עם רדיד הפחמן של הרשת.
לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של ג'ל PLPP לרשת ופיפטה בעדינות כדי לערבב. הזז את כיסוי הכיסוי עם הרשת למיקום חשוך לייבוש. הג'ל יתייבש תוך 15 עד 30 דקות.
עבור micropatterning, לפתוח את התוכנה עם תצוגה חיה ברייטפילד מן המיקרוסקופ. כדי לעצב תבנית חדשה להפעלה ראשונית, בחר הוסף החזר השקעה ובחר עיגול של 3,000 מיקרומטר. מקם את החזר ההשקעה במעגל מעל הרשת באמצעות התמונה Brightfield על המסך כמדריך, ולאחר מכן הקש Lock כדי לאבטח את ההחזר על ההשקעה.
לאחר נעילת ההחזר על ההשקעה במקום, בחרו 'הוסף דוגמת מילוי' ובחרו בתבנית המתאימה. באמצעות אפשרויות השכפול, צור עותקים של התבנית ההתחלתית כדי ליצור אזור ריבוע רשת שמונה על שמונה. התאם את המרווח והזווית לפי הצורך כדי ליישר את התבניות עם ריבועי הרשת.
מקם את התבנית בפינה אחת של הרשת. לאחר מכן, שכפל את התבנית ומקם עותק בכל אחת מארבע פינות הרשת המזיזות את שלב המיקרוסקופ לפי הצורך עבור כל אזור. השתמש באפשרויות השכפול כדי לשנות אזור ריבוע רשת שמונה על שמונה לאזור ריבוע רשת של שניים על שמונה שימוקמו משני צידי המרכז.
השאר את ארבעת ריבועי הרשת המרכזיים לא מרוסנים. עבור כל תבנית, להתאים את המינון הכולל במידת הצורך. 30 מיליג'אול למילימטר מרובע היא נקודת התחלה טובה.
תחת אפשרויות מומחה, חזור על התאמת הזווית, המיקום, הרווח בין התבנית והיחס כדי למקד את היישור של התבנית בריבועי הרשת. הזז את שלב המיקרוסקופ כדי לשנות את אזור הרשת בתצוגת ברייטפילד. לאחר מיקום התבנית והתבניות, בטל את הסימון של כל האזורים פרט לאחד בלוח הפעולה של התוכנה.
השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי לנווט לאזור זה ולהתמקד בנייר הפחמן. לחץ על סמל גלגל העין בחלונית הפעולה כדי להחליף את תצוגת שכבת-העל של התבנית. ברגע שהרשת נמצאת בפוקוס, סגור את התריס של Brightfield ולחץ על סמל ההפעלה בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה כדי להתחיל בתהליך התבנית, שניתן לפקח עליו בשידור חי.
חזור על שלב זה עד שכל האזורים יעוצבו בדוגמתם. לבסוף, להסיר את כיסוי עם הרשת מן המיקרוסקופ ומיד להוסיף 10 microliters של PBS סטרילי על הרשת. לאחר 10 דקות, להסיר את הסטנסיל עם פינצטה, ולאחר מכן לשטוף את הרשת שלוש פעמים עם 15 microliters של PBS ולהשאיר כל רשת PBS במיקום חשוך.
הכינו 15 מיקרוליטרים של המטריצה החוץ-תאית לכל רשת, ולאחר מכן החליפו את ה-PBS מכל רשת ב-15 מיקרוליטרים של המטריצה החוץ-תאית ודגרו את הרשת בתא לח למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, לשטוף כל רשת חמש פעמים עם 15 microliters של PBS סטרילי כפי שהוכח בעבר. לאחר הכביסה הסופית, להשאיר כל רשת ב- PBS.
באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לזהות את פלואורופור במטריצה חוץ תאית כדי לאשר דפוס וכי רדיד הפחמן נשאר שלם. תאי HeLa שנזרעו על רשתות TEM micropatterned ולא מרוסנות נראים על ידי כתמים פלואורסצנטיים באמצעות בדיקת כדאיות תאים מבוססת calcein AM ו- ethidium homodimer-1. באמצעות מטריצה חוץ-תאית מעורבת של קולגן ופיברינוגן, תאי HeLa נצמדים בקלות לדפוסים ברחבי הרשת.
המורפולוגיה הכוללת של תאים שהתרחבו לאורך התבנית דומה לזו של תאים הגדלים על רשתות לא מרוסנות. תמונה של ברייטפילד של תאי BEAS-2B נגועים RSV 18 שעות לאחר הזריעה מראה הידבקות תאים וצמיחה לאורך האזור המרכזי של התבנית. רוב התאים הנגועים ממוקמים לאורך האזור המרכזי בצפיפות גבוהה יותר של תבנית ההדרגה.
וריאנטים RSV ממוקמים קרוב לפריפריה של תאי BEAS-2B נגועים גדל על רשתות micropatterned. חלבונים מבניים רבים של RSV מזוהים בתוך הטומוגרמות, כולל נוקלאוקפפסיד וחלבון היתוך ויראלי. על רשתות micropatterned, נוירונים Drosophila עם ביטוי GFP פאן עצבי ניתן לעקוב בקלות על ידי מיקרוסקופיה אור בשל תיוג פלואורסצנטי ומיקומם להיות בתוך micropatterns.
נוירונים על רשתות לא מרוסנות ניתן גם לעקוב באמצעות GFP איתות על ידי מיקרוסקופיה אור. עם זאת, איתורם במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית הופך לקשה בשל פסולת תאית וזיהום מהתקשורת. בשל הממדים של גוף תא העצב וניוריטים מורחבים, סדרת הטיית טומוגרפיה קריו-אלקטרונית נאספת לאורך אזורים דקים יותר של התאים עם הגדלה גבוהה יותר.
קרום התא העצבי, המיטוכונדריה, המיקרוטובולים, חוטי האקטין, מבני שלפוחית, ומקרומולקולות כגון ריבוזומים נפתרים היטב במונטאז'ים ופרוסות של תמונות הגדלה גבוהות יותר דרך טומוגרמה תלת-ממדית. תכונות תת-תאיות דומות נצפות מטומוגרמוגרמות תלת-ממדיות של נוירונים לא מרוסנים. החלת הסטנסיל על הרשת והוספת ג'ל PLPP הוא הצעד הרגיש ביותר שיכול להשפיע על תוצאות דפוס ויש לעשות זאת בזהירות.
Cryo-CLEM יכול לשמש כדי לוקליזציה של מטרות עניין בתוך תאים לאיסוף נתוני קריו-ET. ניתן להשתמש ב- Cryo-FIB-SEM כדי לדלל תאים באזורים שאחרת עבים מדי לאיסוף נתונים.
