באמצעות כלי מתוחכם ולא פולשני זה, אנו יכולים לעקוב בזמן אמת אחר קינטיקה של גדילת גידולים והתיישבות גרורתית בעכברים, שיש לה פוטנציאל גדול בטיפול בסרטן השד ובניהול מחלות. שילוב של לוציפראז וזיהוי פלואורסצנטי הוא אסטרטגיה מועילה לקידום המחקרים הפרה-קליניים של התקדמות סרטן השד וניהול מחלות. ניתן ליישם זאת עבור מחקרים בתרופות נגד סרטן.
פרוטוקול זה אינו מוגבל לסרטן השד וניתן ליישם אותו על קרצינומות אחרות, כגון ריאות ולבלב. התחילו בגידול התאים MCF-7, MDA-MB-468 ו-MDA-MB-231 GFP ולוציפראז-חיוביים בנפרד בצלחת של 16 ס"מ למפגש של 80%. לאחר קצירת התאים על ידי טריפסיניזציה, זרעו מספר גדל והולך של תאים בכל באר לתוך צלחת שחורה של 96 בארות.
לאחר מכן, מלאו את כל הבארות ב-100 מיקרוליטרים של DMEM, ודגרו במשך 16 עד 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% חממת CO2. מכינים תמיסת לוציפרין ב-PBS בריכוז של 1.5 מיליגרם למיליליטר, ומאחסנים את התמיסה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS בעדינות לפני שתוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת לוציפרין לכל באר.
המתן במשך שתי דקות, ולאחר מכן מדוד את פעילות הלוציפראז בכל תאי סרטן השד באמצעות bioluminescence. לפני הזרקת העכבר, העבירו חמישה מיליון תאי MCF-7 ו-MDA-MB-468 ל-200 מיקרוליטרים של PBS ושני מיליון תאי MDA-MB-231 GFP ולוציפראז חיוביים ל-100 מיקרוליטרים PBS. הכן את העכבר המרדים להזרקה על ידי הצבת חרוט מעל הראש בתנוחת שכיבה.
לאחר מכן, נגבו את אזור הבטן של העכבר מעל בלוטת החלב עם אתנול באמצעות צמר גפן, והרימו את בלוטת החלב הרביעית עם מלקחיים לפני החדרת מחט בעלת 27 מדים מתחת למשטח השומן כדי להזריק באיטיות 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא המוכן. לאחר ההזרקה, מוציאים את העכבר ממכסה המנוע ומעבירים אותו לכלוב חדש תחת השגחה עד שהוא חוזר להכרה. לפני זיהוי הביולומינסנציה, לרסן את העכבר המודע על ידי החזקת צווארו ביד שמאל והטיית היד שמאלה, וכתוצאה מכך פני העכבר כלפי מעלה עם פלג הגוף התחתון במצב שכיבה.
הזריקו 100 מיקרוליטרים של 30 מיליגרם למיליליטר לוציפרין תוך-צפק לתוך רביע הבטן השמאלי התחתון של העכבר באמצעות מזרק של מיליליטר אחד. שמור את העכבר במשך שבע דקות ללא הרדמה, ולאחר מכן שלוש דקות בתוך תא ההרדמה לפני מדידת הקינטיקה של הגידול. בזמן שהעכבר נמצא תחת דגירה, פתח את התוכנה ואתחל את מערכת ההדמיה על ידי לחיצה על לחצן אתחול.
שמור על ההגדרה בחשיפה אוטומטית עם זמן חשיפה באוטו ב- 60 שניות, חיבור בינוני בצמצם של f / stop one, מסנן עירור חסום ומסנן פליטה פתוח. כאשר האתחול מסתיים, בחר אשף הדמיה ו- Bioluminescence ולאחר מכן לחץ על הבא, פתח את המסנן כדי לבחור עכבר בנושא התמונה. בתצוגת השדה, בחר שלב C ב- 10 ס"מ וגובה הנושא ב- 1.50 ס"מ.
לאחר מכן, לחץ על שלב הגדרת התמונה כדי C.ודא שהעכבר ממוקם על הבמה במצב שכיבה תקין לפני סגירת הדלת ולחיצה על לחצן רכוש. המתן עד שתמונה תופיע על המסך. חזור על ההליך עבור העכבר השני.
כדי לזהות גרורות בריאות, יש לכסות את האות החזק של הגידול הראשוני באמצעות נייר קרטון עבה ולחשוף רק את הצד הגחוני של הריאות לכיוון המצלמה. צלם את התמונה באמצעות אותם פרמטרים שתוארו קודם לכן. קווי תאי סרטן השד היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס המבטא GFP פלואורסצנטי וכפוף למיון FAC.
התאים החיוביים ל-GFP מוינו יומיים לאחר ההדבקה, צופו והודמיינו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פעילות לוציפראז במבחנה אושרה עם עלייה תלוית מספר תאים ברמות הפעילות של לוציפראז. בנוסף, נמצא מתאם ליניארי בין פעילות הלוציפראז לבין מספר התא.
לאחר הזרקת קווי תאי סרטן השד, העכברים היו נתונים לקריאת ביולומינסנציה כל שבועיים כדי לקבוע את קינטיקה של צמיחת הגידול. קינטיקה של גדילת הגידול הייתה מהירה יותר בקווי התאים MDA-MB-231 מאשר בקווי התאים הפחות אגרסיביים, MCF-7 ו-MDA-MB-468. פעילות הזוהר כומתה עבור שלושה קווי תאים.
שישה שבועות לאחר ההזרקה, הגידולים שנקטפו נמצאו שומרים על ביטוי ה-GFP. כמו כן, קריאות ביולומינסנציה חיוביות התקבלו מריאתו של העכבר כולו בזמן אמת. הריאה נקטפה כדי לאמת מושבות גרורתיות חיוביות, והמושבות הגרורות נצפו עבור GFP וביולומינסנציה.
חשוב יותר להיות זהירים בעת ביצוע הליך ההזרקה. זריקה לא נכונה עלולה להוביל לסטייה בקצב הגדילה של הגידול או להיעדר גידול. אנו יכולים לבחון את גרורות הריאה in vivo ו- ex vivo על ידי זיהוי ביטוי GFP.
בנוסף, אנו יכולים גם לחקור את ההיסטופתולוגיה של הריאות על ידי צביעה מבוססת אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו יכולה להיות שימושית כדי לחקור את השאלות החדשות, כגון ההשפעה של מחקרי יעילות תרופות.
