הפרוטוקול שלנו יכול לשמש במהירות ובקלות לבדוק את התפקיד של כל גן מועמד קולוניזציה גרורתית וצמיחה. הפרוטוקול מאפשר גם ניטור בזמן אמת של גרורות, היווצרות וצמיחה, כמו גם כימות של מספר גרורות וגודל באותם בעלי חיים ללא צורך בתיקון או כתמים היסטולוגיים. לוח ארבעה תאים T1 ב 150, 000 תאים לגם בצלחת 12 באר במדיה צמיחה מלאה.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני לילה. למחרת, שאף את תקשורת הצמיחה מהתאים. הוסף 500 מיקרוליטרים של על-טבעי ויראלי לוציפראז ו-500 מיקרוליטרים של חלבון פלואורסצנטי נגיפיים כדי להדביק בו זמנית את התאים הן עם החלבון הלוציפראז והן עם חלבונים פלואורסצנטיים.
לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של שמונה מיליגרם למיליליטר הקסדימתרין ברומיד ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. טריפסיניזציה של ארבעת תאי T1 עם 500 מיקרוליטרים של טריפסין. לאחר שתיים עד חמש דקות, להעביר את כל התאים לצלחת שישה סנטימטרים בארבעה מיליליטר של מדיה הבחירה, ובכך מרווה את טריפסין.
לאחר השלמת הבחירה, אשר כי ארבעת תאי T1 הנגועים מבטאים חלבון פלואורסצנטי ZsGreen באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של פי 50 עד 100. כמו כן לאשר כי ארבעה תאים T1 נגועים מבטאים luciferase באמצעות ערכת פעילות לוציפראז זמין מסחרית. המשך לבצע אופטימיזציה של העיצוב הניסיוני in vivo כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
שאפו את המדיה ושטוף את לוחות התאים עם PBS 1X. טריפסין התאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין לכל צלחת 15 ס"מ במשך שתיים עד חמש דקות ולהעביר את כל התאים לצינור חרוט. לשטוף את התאים הנותרים מן צלחת תרבות הרקמות עם מספיק מדיה צמיחה מלאה כדי לרוות את טריפסין.
מוסיפים את הכביסה לאותו צינור חרוט. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התא הכולל. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 122 פעמים G במשך שלוש דקות, ושואפים את העל טבעי.
להשעות מחדש את התאים PBS 1X בריכוז הרצוי. כאן, 25, 000 תאים מוזרקים לתוך כל עכבר ו 100 microliters של PBS. אז התאים המושעים מחדש הם ב-250,000 תאים למיליליטר.
שמור את המתלים התא על קרח עד הזרקה. עבודה במכסה המנוע במתקן בעלי החיים, בעדינות אך ביסודיות לערבב את התאים על ידי היפוך הצינור או באמצעות מזרק מיליליטר אחד כדי להבטיח כי הם מושעים מחדש באופן אחיד. עכשיו, לטעון מזרק לולר לוק אחד מיליליטר עם ההשעיה התא לגרש בועות אוויר עודף.
מניחים מחט חצי אינץ ' 30 מד על המזרק עם שיפה למעלה לגרש בועות אוויר. מניחים בעדינות את העכבר במכרסם. וריד הזנב האחורי צריך להיות גלוי ומופחת.
אם לא, יש לצבוט בעדינות את בסיס הזנב ולטבול את הזנב במי ברז חמים כדי לטבול את הוורידים. השתמש לנגב אלכוהול כדי לנקות את הזנב, ולאחר מכן להכניס את המחט לתוך וריד הזנב, צד משופע למעלה, ולהזריק 100 microliters של השעיית התא. אם המחט מוכנסת כראוי לתוך וריד, זה צריך בקלות להחליק מעט קדימה ואחפה, ולא צריך להיות התנגדות כאשר הבוכנה הוא דחף.
זריקות מוצלחות צריך גם לגרום סומק שבו הצבע הכחול של הוריד הופך לבן במשך כמה שניות לאחר ההזרקה. לאט להסיר את המחט, באמצעות גזה סטרילית, להפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי לעצור כל דימום. להחזיר את העכבר לכלוב שלה לפקח במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.
הפעל את התקן ההדמיה החיה של in vivo, פתח את תוכנת התמונה והיכנס. לחץ על לחצן האתחול והמתן לאתחול המחשב. שנה את שדה התצוגה ל- D. לשימוש ראשון, ערוך הגדרות חשיפה על-ידי לחיצה על עריכה, העדפות, רכישה וחשיפה אוטומטית.
שנה את זמן החשיפה המרבי מ- 60 השניות המוגדרות כברירת מחדל ל- 300 שניות ולחץ על אישור. לטעון מזרק מיליליטר אחד עם D-luciferin, ולאחר מכן להוסיף חצי אינץ ' 30 מחט מד למזרק לגרש בועות אוויר. למדוד ולתקליט את המסה של עכבר הרדמה.
רסן את העכבר על ידי צביטת עורף הצוואר באמצעות האגודל ואצבעות המצביע ותפיסת הזנב בין האצבע הזרת לבסיס היד. היפוך העכבר בזווית של 45 מעלות כשראשו מצביע כלפי מטה. הכנס את המחט, שיפוע צד למעלה, לתוך שטח IP בצד שמאל של העכבר.
אשר את הכניסה לשטח ה- IP על-ידי משיכת אמצעי אחסון קטן. לא צריך להיות צבע בבסיס המחט בעת ציור בחזרה בחלל ה-IP. להזריק את הנפח המתאים של D-לוסיפרין עבור מנה של 150 מיליגרם לקילוגרם.
מיד לאחר ממשל D-לוציפרין, להתחיל טיימר. מניחים את העכבר שטוח על גבו במכשיר ההדמיה עם אפו בקונוס האף, ולהבטיח כי אחד חצי עד שניים וחצי אחוז isoflurane מנוהל. לחץ על תיבות זוהר וצילום.
שנה את זמן החשיפה לאוטואי ולאחר מכן לחץ על רכוש בלוח הבקרה של הרכישה. לאחר ההדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלה לפקח במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה. בעקבות המתת חסד, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, לבודד ולהסיר את הריאות מכל עכבר ולשטוף ב 1X PBS כדי להסיר דם עודף.
לרכוש תמונות של גרורות ZsGreen באונות ב 10X בברייטפילד פלואורסצנטי באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן פס רחב GFP. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת את הגודל והמספר של גרורות מהתמונות. כדי לעבד ולנתח את הנתונים מהתמונות שנרכשו באמצעות התקן ההדמיה החיה in vivo, פתח את כל קבצי התמונה עבור כל עכבר בתוכנת התמונה.
ודא כי היחידות הן זוהר עבור נתונים bioluminescent ויעילות עבור נתונים פלואורסצנטיים על ידי לחיצה על החץ בחלק השמאלי העליון של חלון התמונה ושינויו ליחידה המתאימה. השתמש בתמונה מנקודת הזמן האחרונה כדי ליצור אזור מעניין, או ROI, על-ידי לחיצה תחילה על כלי ROI בחלון לוח הכלים. לאחר מכן, הוסף ROI אחד על-ידי לחיצה על החץ ובחירתו.
לחץ על הגבול של ROI והזז אותו אל החזה של העכבר. התאם את גודל ההשקעה כך שהיא תכסה את החזה של העכבר ולא תכלול אות. לאחר מכן, לחץ על למדוד את מספר ההשקעה ולהעתיק או להקליד את המספר הגולמי בגיליון Excel.
התווה ונתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בקובץ התמונה כדי להעתיק את ה- ROI ולאחר מכן הדבק אותו בקבצי תמונה מנקודות הזמן האחרות ולחץ על למדוד ROIs. וקטור רטרו-ויראלי המבטא shRNAs מבוססי טנדם miR-30 המכוונים הן YAP והן TAZ מפחית ביטוי YAP וחלבון מס ופעילות שעתוק בארבעה תאי T1.
ארבעה תאי לוציפראז T1 התומרו באופן הדוק עם גרסה מבטאת ZsGreen של וקטור YAP/ TAZ shRNA דו-מושבי זה או shRNA מבוקר מבוסס miR-30. תמונות ביולומינסנטיות מראות כי הקצב שבו הנטל גרורתי גדל היה מהיר משמעותית בעכברים שהוזרקו לתאי בקרה בהשוואה לעכברים שהוזרקו לתאי הפלה YAP/TAZ. חלקה של log10 הפך אות luciferase נמדד עבור כל עכבר במהלך הניסוי גם מראה כי הקצב היה מהיר יותר בעכברים מוזרק עם תאי הבקרה לעומת העכברים מוזרק עם תאי נוקאאוט YAP / TAZ.
באופן משמעותי פחות גרורות נוצרו בעכברים מוזרק עם תאי הפלה YAP / TAZ לעומת עכברים עם תאי בקרה כאשר נספרים באופן ידני. אותה מגמה נצפתה בעת שימוש בתוכנת ניתוח התמונה. לא רק שרבות גרורות נוספות נוצרו בעכברי הבקרה, הן היו בדרך כלל גדולות יותר.
באופן עקבי, הנטל גרורתי בריאות גם הופחת באופן דרסטי על ידי YAP / TAZ להפיל. הזרקה מוצלחת של מספרים שווים של תאים בריאים לכל עכבר היא קריטית כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה. זכור לנקוט זהירות ופעל בהתאם להנחיות הבטיחות בעת עבודה עם רטרווירוסים זיהומיות lentiviruses, במיוחד אם הנגיפים הם זיהומיות אנושיות.
טכניקה זו אפשרה לנו להמחיש את התפקידים של גנים מועמדים קולוניזציה גרורתית וצמיחה, מתן דרך לזהות ולבדוק מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול במחלות גרורתיות. בעקבות הליך זה, גרורות המכילות ריאות ניתן לנתח עוד יותר על ידי כתמים immunofluorescent או היסטולוגית כדי לחקור כיצד הגן השתנה משפיע על גרורות ולזהות חלבונים אחרים שעשויים להיות מעורבים.
