הקמנו טכנולוגיית פלטפורמה עבור SARS COVID 2 שיכולה להיות ישימה לווירוסים אחרים עם זיהוי תאים בתיווך ספייק וכניסה כצעד הראשון בזיהום ויראלי תאי. נקודות קוונטיות בהירות, יציבות, וניתן לתפקד על פני השטח שלהן עבור מגוון יישומים תאיים. בשיטה זו, אנו יכולים לדמיין ולמדוד הפנמה של ספייק לתאים.
כדי להכין 0.1%BSA. הוסף 130 מיקרוליטרים של 7.5%BSA ל-10 מיליליטר של מדיית הדמיה בתערובת. עבור דילול סדרתי של 6.1 עד 3 ומשולש להוסיף 14.26 מיקרוליטרים של QD ספייק ל 285.74 מיקרוליטרים של 0.1%BSA כדי להפוך את הריכוז הגבוה ביותר של 20 nanomole.
לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטרים של 20 nanomole או QD ספייק ל 200 microliters של 0.1% BSA כדי להפוך את האשליה השנייה של 6.67 ננומול QD ספייק. הסר את כל המדיה המבוזבזת מכל באר עם שאיפה רב ערוצית, שטוף פעם אחת עם פיפטה רב ערוצית עם 100 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה לבאר, ואז שאף 100 מיקרוליטרים של מדיית ההדמיה. מוסיפים בחזרה 50 מיקרוליטרים של פתרון QD Spike לבאר ודגור על הצלחת במשך שלוש שעות בחממה לחה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לבושים בציוד מגן, הכינו 4% PFA ו-0.1%PSA הדמיה בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי, שאפו 50 מיקרוליטרים של QD Spike מכל באר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של 4%PFA לבאר עם פיפטה רב ערוצית אוטומטית כדי להימנע מייבוש הבארות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להכין את הצבע הגרעיני האדום העמוק על ידי דילול פתרון מלאי חמישה מילימטר באחד עד 1000 ב PBS, לשאוף PBS ולהוסיף בחזרה 50 מיקרוליטרים של צבע גרעיני מדולל לכל באר. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז לשטוף שלוש פעמים עם PBS, לדחוף את הצלחת או לאטום אותה באמצעות אטם צלחת להדמיה מאוחר יותר.
יש לאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנה עבור פלטפורמת ההדמיה. לאחר הכניסה לפלטפורמת ההדמיה צור פרוטוקול רכישה חדש על ידי בחירת סוג צלחת כלוח הדמיה תחתון שקוף 96 קיר, מצב אופטי נבחר הלך מוקד והגדלה כמו 40 פעמים טבילה במים, בחר binning כאחד.
בחר את המצב עבור ניגודיות פנים דיגיטלית כגון ניגודיות גבוהה כדי לייצר גופי תא מוגדרים היטב. צלם תמונה כדי לאשר שכותרת זו מתאימה כפי שניתן לראות בחלון התמונה, בחר בערוץ C המתאים לשימוש עם קו התא ACE2-GFP כדי להציג באופן חזותי סחר ב- ACE2 בתוך התא. ליצירת ערוץ QD מותאם אישית, בחרו בתפריט הנפתח של המשולש ובחרו את העירור בטווח של 405 ננומטר בפליטה בטווח של 608 ננומטר, בחרו באר עם אות QD ציטופלסמי חזק כדי להגדיר את זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום הגובה של Z.
בדוק אם גובה ברירת המחדל מפיק תמונה של התאים במישור המוקד הרצוי. מיקום Z יהיה נמוך יותר עבור puncta אנדוציקטוז מאשר מיקום Z עבור קרום הפלזמה. בחר זמן חשיפה, בדרך כלל בין 100 ל- 300 אלפיות השניה, המפיק תמונה בהירה עם רמות אפורות, הגדולה לפחות פי שלושה מאות הרקע.
ב 20 ננומול רמות האפור צריך להיות כ 6, 000 יחידות אטומיות עם 200 אלפיות השנייה זמן חשיפה ו 80% כוח לייזר. בדוק את רמות האפור על ידי לחיצה ימנית על התמונה המיוצרת עם תכונת התמונה בכל ערוץ ובחירת עוצמת המופע, ולאחר מכן לחץ שמאלה על האובייקט של עניין או רקע כדי להציג את רמת האפור עבור פיקסל זה, להתאים את כוח הלייזר כדי לכוונן את עוצמת האובייקטים של עניין. שמור את פרוטוקול הרכישה, לעבור כדי להפעיל ניסוי ולהזין את שם הלוחית, להפעיל את הניסוי.
טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 הומחשה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקו תא מבטא ACE2-GFP. פילוח תמונה וניתוח שלאחר מכן בוצע כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים כגון ספירת ספוט. ראשית, גרעינים היו מקוטעים מערוץ הסמן הגרעיני כדי ליצור אוכלוסיית החזר על ההשקעה.
לאחר מכן, אזור החזר השקעה המתאר את התא עם פילוח באמצעות ערוץ ACE2-GFP. לבסוף, כתמי ספייק QD 608 היו מפולחים מאזור החזר על ההשקעה בתא, אותות QD ו- ACE2 מופנמים הראו לוקליזציה משותפת חזקה. ניסוי תגובת ריכוז עם שישה ריכוזים שונים של QD ספייק בוצע בתאי HEK 293T.
קביעת ריכוזים אופטיים של QD, QDS יכול לשמש נמוך כמו 2.22 nanomole, עם זאת, מומלץ להשתמש בריכוזים של 10 nanomole ומעלה כדי להבטיח תגובה חזקה. במהלך ההטיה לצבירה של חלבון QD עלולה להתרחש. אגרגטים נצפו בתמיסת QD כמשקעים מגושמים בהירים ותאי HEK 293T, QDs דוגר עם נוגדנים מנוטרלים החל מ 30 מיקרוגרם למיקרוליטר לפני תוספת לתאים, נוגדנים אלה חסמו הפנמה מחייבת וגרמו לירידה בספירת הספוט בהשוואה לתאים שטופלו ב- QD בלבד.
מאמר זה יכול לשמש גם להקרנה בתפוקה גבוהה, הערכת עופרת של נטרול נוגדנים כדי לזהות אנטי-ויראליים של משחק מילים לכניסה ויראלית בלוק ולהיות מותאם ללמוד גרסאות חדשות המתעוררות.
