זהו פרוטוקול קל ודמיוני המדגים טיפול באורגנואידים אדנוקרצינומה של הוושט בשני תהליכי תת-תרבות שונים עם וללא עיכול של תא יחיד. הפרוטוקול הסטנדרטי לתת-תרבויות אורגנואידים של EAC בשתי שיטות שונות יכול לתמוך בחוקרים בבחירת טכניקות מתאימות ליישומים שונים במורד הזרם בניסויים מבוססי EAC PDO שלהם. תוך כדי התמודדות עם PDOs, חיוני לשים לב לפרטים בכל שלב.
SOP מבוסס צוות הוא חיוני לאיכות ה- PODs. מי שידגימו את ההליך יהיו אחת מתלמידות הדוקטורט שלנו, נינג בו פאן, וליסה רץ, עוזרת הטכניקה של המעבדה. יש לחמם מראש צלחת של 12 בארות על ידי דגירה לילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות פחמן דו-חמצני.
אם זמין, השתמש בבארות ריקות מצלחת עם תרבית האורגנואידים שמקורה בחולה. דגירה בנפח מתאים של ג'ל ECM למשך שעה אחת על קרח כדי להנזיל. הניחו את תמיסת שחזור התאים על הקרח.
הסר את הצלחת עם PDOs גדלים מהאינקובטור. לשאוף למדיום ישן באמצעות משאבת ואקום. הוסף 500 מיקרוליטרים לכל כיפה של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח לתוך הבאר.
פירקו את ג'ל ה-ECM על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפצל כיפות ג'ל ECM לחתיכות קטנות באמצעות 1, 000 קצות מיקרוליטר עם פתח רחב. שלבו את תמיסת ה-PDO, ג'ל ה-ECM והתאוששות התאים משתי בארות לכל היותר והעבירו אותה לצינור בעל קשירה נמוכה של חמישה מיליליטר. דגירה של צינור זה על קרח במשך 20 דקות.
מערבבים כל חמש דקות על ידי היפוך הצינור. צנטריפוגה של הצינור במהירות של 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. אם אין גלולה נראית לעין, הסר בזהירות את ה-supernatant עם משאבת ואקום עד שתגיע לשלב המכיל תמיסת PDO של ג'ל ECM והוסף שלושה מיליליטרים של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח.
הופכים את הצינור כמה פעמים ודוגרים על קרח עוד 10 דקות. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את ה-supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום או פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר.
נסה להסיר את supernatant ככל האפשר. אחסנו את גלולת ה-PDO על קרח. הסר טיפים 201, 000 microliter מקורר מראש עם פתח רחב מהמקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס והנח אותם על ספסל נקי.
חשב 50 מיקרוליטרים של ג'ל ECM לכל כיפה המתוכננת לזריעה, בתוספת 50 מיקרוליטרים נוספים. לאחר מכן יש לבצע שימוש חוזר בכדור בג'ל ECM באמצעות קצה 1, 000 מיקרוליטר מקורר מראש ולערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה כ-10 פעמים. מוציאים את צלחת 12 הבאר שחוממה מראש מהאינקובטור לפני זריעת הכיפות.
זרעו את הכיפות המכילות 50 מיקרוליטרים של ג'ל ECM לתוך הצלחת החמה. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 עד 30 דקות כדי לחזק את ג'ל ה-ECM. הוסיפו את מדיום ה-PDO המחומם מראש בזהירות מבלי להפריע לכיפות.
עקוב אחר PDOs שנזרעו מתחת למיקרוסקופ. תרבית את ה-PDOs למשך 7 עד 14 יום עד להתרחשות הצפיפות והמורפולוגיה הנדרשות. הכן את מדיום העיכול על ידי ערבוב שני מיליליטרים של 0.25% טריפסין EDTA ו-20 מיקרוליטרים DNAase I לעיכול PDOs שנקטפו משתי בארות.
בצעו החייאה של הכדור שהוכן בעבר בנפח מתאים של 0.25% טריפסין EDTA ו-DNAase I שחוממו מראש וערבבו אותו כ-10 פעמים על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מסתובב עם מהירות סיבוב של מינימום של 28 סל"ד. הכינו צינור 15 מיליליטר המכיל שישה מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין סויה.
לאחר העיכול, ערבבו היטב את ה-PDOs המעוכלים כמה פעמים עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לשבש את ה-PDOs. העבר את ה- PDOs המעוכלים לצינור 15 מיליליטר המכיל תמיסת SDI כדי לעצור את העיכול. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשליך את ה-supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום או פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. החייאת הכדור במיליליטר אחד של מדיום בסיסי. קבעו את ריכוז התאים ואת יכולת הכדאיות שלהם באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
חישבו את מספר התא לפי הכיפות המתוכננות לזריעה, בתוספת כיפה אחת נוספת, והעבירו אותן לצינור טרי בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך בזהירות את חומר העל באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר.
הוסיפו נפח מתאים של ג'ל ECM לכדורית באמצעות קצה פתח רחב של 1, 000 מיקרוליטר מקורר מראש. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה בערך 10 פעמים. זרעו את ה-PDOs המעוכלים לתוך צלחת של 12 בארות כפי שהוכח בעבר.
התחל בתהליך שימור בהקפאה של מחשבי כף יד לא מעוכלים עם גלולה שהוכנה בעבר. השתמשו ב-500 מיקרוליטרים של מדיום הקפאה קר כדי להחיות את הכדור משתי כיפות ולהעביר אותו לבקבוקון קריוגני. הקפיאו את ה-PDOs למשך הלילה במקפיא באמצעות מיכל הקפאת תאים מתאים.
מעבירים את ה-PDOs הקפואים למקפיא של מינוס 150 מעלות צלזיוס. לצורך שימור בהקפאה של PDOs מעוכלים, העבירו תאים לצינור טרי בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשליך את הסופרנטנט בזהירות באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. בצעו החייאה של הכדור ב-500 מיקרוליטרים המקפיאים את מדיום והעברתו לבקבוקון קריוגני. הקפאו את ה-PDOs למשך הלילה במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס באמצעות מיכל הקפאת תאים מתאים והעבירו אותם למקפיא של מינוס 150 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
תת-תרבות ללא עיכול חד-תאי לוקחת פחות זמן להגיע לצפיפות דומה ומובילה בעיקר למבנים קומפקטיים. לעומת זאת, ה-PDOs המעוכלים של התא הבודד מראים מבנים עם ליבה חלולה. האיור מראה את צביעת האאוזין של המטוקסילין ואת הכתמת האימונוהיסטוכימיה של מחשבי כף יד EAC משובצי פרפין עם מבנים קומפקטיים וחלולים.
הפנקיטוקראטין מאפשר זיהוי של תאי גידול אפיתל. הציטוקרטין 7 מדגיש את תאי הגידול המובחנים בבלוטות. המבנה הקומפקטי קיים בעיקר בתרבית הלא מעוכלת, בעוד שהמבנה החלול דומיננטי בתרבית שעברה עיכול חד-תאי.
ה-Ki67 מדגיש את אוכלוסיות התאים עם התפשטות תאית גבוהה יותר. ה-Ki67 באדום וה-PanCK בירוק התפלגו באופן דומה בין הרקמה הראשונית של EAC, המבנה הקומפקטי EAC PDO והמבנה החלול של EAC PDO. האיור מראה מאפיינים מורפולוגיים של PDOs EAC ביום הראשון של ההתאוששות ממלאי קפוא עם שימור בהקפאה על בסיס תא יחיד ושימור בהקפאה מבוססת PDO לא מעוכלת.
אנו ממליצים להכין מראש תוכנית ברורה של תת-תרבות. בקרת טמפרטורה ופיפטינג עדין חיוניים לטיפול נכון בג'לים של ECM בעת תת-תרבות של PDOs. הפרוטוקול שלנו מספק לחוקרים את המהות לשמירה על ה-EAC PDOs שלהם בהתאם למטרת המחקר שלהם לניתוח במורד הזרם כגון בדיקת סינון תרופות, ציטומטריית זרימה או ניתוח היסטולוגי.
אנו מקווים שעבודתנו תוכל לסייע לחוקרי אורגנואידים לקבל החלטות מהירות וקלות עבור האחסון ותת-התרבות של האורגנואידים, במיוחד עבור תוצאות חזקות של חומרים שמקורם בחולה במחקר תרגומי.
