קרצינומה של תאי קשקש בוושט, ESCC, היא קטלנית ונפוצה ברחבי העולם. ניתן להשתמש באורגנואידים תלת מימדיים כדי להאיץ את ההתקדמות בתחום כדי להילחם בנטל החמור של ESCC. אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בתא בודד מעכברים שטופלו ב-4NQO ניתנים למניפולציה קלה וזולה לצורך ביאור פונקציונלי של השינויים המולקולריים הנלווים לאתחול והתפתחות של ESCC.
מודל זה לוכד את ההטרוגניות הגנטית של גידולים הנגרמים על ידי מוטגן. לכן, אורגנואידים אלה מספקים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לבחון אסטרטגיות טיפוליות חדשניות או לזהות את השינויים הגנטיים הבולטים המניעים גידולים. מי שיעזור להדגים את נתיחת בעלי החיים ואיסוף האיברים יהיה יאסוטו טומיטה, עמית צוות, ומי שידגים את הכנת האורגנואיד להליך שיבוץ פרפין יהיה נוריהירו מאטסורה, עמית מחקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לפתוח את העור של עכברים מורדמים על ידי צביטת הפרווה באמצע הבטן באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך craniocaudal, קו האמצע הגחוני מן הבטן התחתונה אל הסנטר. החל מהחתך בקו האמצע, לבצע חתכים רדיאליים המשתרעים על הגפיים משני צידי העכבר, לנפח את דשי העור פתוח. כדי לחשוף את קנה הנשימה הצווארי, באמצעות מספריים ניתוח, לחלק את בלוטות הרוק בקו האמצע.
כדי לחשוף את קנה הנשימה החזי, להסיר את עצם החזה. צובטים בעדינות ומרימים את הצפק במלקחיים ומשתמשים במספריים כדי לחלק את הצפק באופן קרניוקולי. ולרוחב לאורך כלוב הצלעות.
משכו בעדינות את הכבד מהמשטח הקאודלי של הסרעפת והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן בסרעפת בחריץ עצם החזה, במיוחד במשטח הגבי של תהליך הקסיפואיד. לאחר הפרדת כלוב הצלעות מתכולת בית החזה, הכניסו מספריים לחתך בסרעפת ונתחו גולגולתית לחגורת צוואר הרחם הנצמדת היטב למשטח הגבי של עצם החזה כדי למנוע נזק לאיברים שמתחת. חותכים את הצלעות משני צדי עצם החזה באמצעות מספריים ומסירים את עצם החזה.
כדי לחשוף את הוושט הבטן, להרים בעדינות את הבטן הקדמית על ידי החזקת האנטרום עם מלקחיים. בעזרת מספריים מנתחים את הטחול, הלבלב והמזנטריה מהקיבה והוושט. כדי לחשוף את הוושט החזי, להרים בעדינות את קנה הנשימה מיד caudal לסחוס בלוטת התריס, ולנתח את הוושט של הצד הגבי של קנה הנשימה באמצעות מספריים הקשתית.
מחלקים את קנה הנשימה בסחוס בלוטת התריס בעזרת מספריים של הקשתית. מקלפים את קנה הנשימה משארית הוושט על ידי ניתוחו בזהירות בכיוון הקאודלי. הוציאו את הריאה, הלב ובלוטת התימוס לחלוטין מקנה הנשימה.
מחלקים את הבטן בפילורוס עם מספריים. להפריד את הוושט מן החוליה על ידי החזקת האנטרום עם מלקחיים לנתח גולגולת. מחלקים את הוושט לרמה של סחוס בלוטת התריס וקוצרו את הוושט והקיבה לגמרי.
הפרידו את הקיבה והוושט על ידי חלוקת הוושט בקרדיה ונתחו כל פאשיה על פני השטח החיצוניים של הוושט. כדי להזמין מדגם עבור היסטולוגיה, לפצל אורך עם מספריים. מניחים את שארית הוושט וה-PBS הקר על קרח.
פתח את הבטן לאורך העקמומיות הגדולה יותר ושטוף עם PBS מספיק. יש להפריד את הבטן הקדמית ולשטוף עם PBS קר. כדי לקצור את הלשון, להסיר את המחט נעוצה מן האף ולשלוף את הלשון עם פינצטה.
חותכים את הלשון זמן רב ככל האפשר ומניחים אותה PBS קר על קרח. לאחר העברת הרקמה המנותקת לצלחת תרבית, להסיר בזהירות את שכבת השריר מן האפיתל באמצעות מלקחיים. מעבירים את האפיתל לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 500 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין ודגרים בתרמומיקסר למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-800 סל"ד.
לאחר צנטריפוגה קצרה, העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר המוחזקת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם קצה רחב באמצעות תנועות מעגליות, לאחר מכן הוסיפו 3 מיליליטר של מעכב טריפסין סויה, או STI, דרך המסננת באמצעות תנועות מעגליות כדי לשטוף, ואז לקרצף את המסננת עם בסיס של מזרק שחפת 1 מיליליטר כדי לדחוף את התאים דרך. לשטוף את המסננת עם 3 מיליליטר של PBS 3 עד 5 פעמים, קרצוף המסננת עם הבסיס של מזרק בין שטיפות. לאחר הורדת התאים על ידי צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט והשאיר 1 מיליליטר של תמיסה בצינור להשעיה מחדש.
לאחר השעיית הגלולה מחדש, העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של הצינור שוב, השהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מדיום אורגנואיד עכבר, או MOM, ובצע ספירת תאים אוטומטית. צלחת 5, 000 תאים קיימא ב 75% תמצית קרום מרתף, או BME, ו MOM עם נפח כולל 50 מיקרוליטר לכל באר.
בעזרת קצה רחב של 200 מיקרוליטר, מוסיפים לאט טיפת 50 מיקרוליטר למרכז כל באר תוך הימנעות ממגע בין הקצה לתחתית או לצדדים של הבאר. לאפשר BME להתמצק במשך 30 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות יחסית. לאחר הדגירה, בזהירות להוסיף 500 מיקרוליטר של MOM לכל באר.
שנה את MOM ביום 3 או 4, ולאחר מכן כל 2 עד 3 ימים לאחר מכן עד מוכן למעבר. יש לשמור את ה-BME המופשר על קרח, לחמם מראש את MOM, 0.05% טריפסין ו-STI לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. בעזרת קצה מיקרופיפטה רחב משעמם, אספו את האורגנואידים בכיפת ה-BME יחד עם הסופרנאטנט ושבשו את ה-BME על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
לאחר קבלת גלולת האורגנואיד על ידי צנטריפוגה קצרה, ברגע שהוא נעקר, להשעות אותו מחדש ב 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין. דוגרים על הצינור בתרמיקסר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-800 סל"ד למשך 10 דקות. להשבית את טריפסין עם 600 מיקרוליטר של STI.
לאחר צנטריפוגה והשלכת supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 מיקרוליטר של MOM. בצע ספירת תאים אוטומטית על-ידי אי-הכללה של כחול טריפאן. כדי לתקן את האורגנואידים, עקרו בעדינות את הגלולה והשהו מחדש ב-300 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכינו משטח הטבעה על ידי היפוך מתלה צינור מיקרוצנטריפוגה וכיסוי המשטח בסדין של סרט תקרה, ולאחר מכן תוויתו עם מזהה האורגנואיד המתאים. כיסו בזהירות את הפרפורמלדהיד שהוסר בגלולת אורגנואיד שטופה PBS על ידי הוספת 50 מיקרוליטר אגר בצד הצינור. חזור על שלב זה.
מבלי להפריע לכדור, מעבירים את הגלולה בטיפת אגר ג'ל לסרט התקרה על משטח ההטבעה למיצוק ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. בעזרת מלקחיים, מעבירים בזהירות את הטיפה המכילה את גלולת האורגנואיד המוצקה לקלטת פתולוגיה מסומנת. האורגנואידים הרגילים של לשון הוושט והקיבה הקדמית נותחו מורפולוגית על ידי הדמיית שדה בהיר וצביעה היסטולוגית.
קרצינומה של תאי קשקש בוושט מעכבר שטופל ב-4NQO הציגה אטיפיה גרעינית וקרטיניזציה פתאומית. יכולת ההתחדשות העצמית של אורגנואידים שהוערכה על ידי קביעת קצב היווצרות האורגנואידים על תת-תרבית הראתה כי קצב ההיווצרות יורד כפונקציה של זמן המשקפת ירידה בתאי בזלואידים מתרבים באורגנואידים שהתבגרו. קינטיקה הגדילה של האורגנואידים מתגלה על ידי המורפולוגיה שלהם בנקודות זמן שונות.
קרטיניזציה של הליבה הפנימית של אורגנואידים הופכת בולטת ביום ה-10. תאי הבזלואיד המתרבים נשארים בשכבת התא החיצונית ביותר, אפילו ביום ה-14 וביום ה-21 בנקודות הזמן. עקומת הכפלת אוכלוסייה של אורגנואידים נורמליים של לשון עכבר שנוצרו מעכברים לא מטופלים ב-4NQO מדגימה את גדילתם היציבה על פני מעברים מרובים ותרבית ארוכת טווח.
אורגנואידים הם פלטפורמות לסינון בתפוקה גבוהה לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות, עריכה מבוססת קריספר לחקירת תפקוד גנים ספציפי או תרבית משותפת כדי להגדיר אילו אינטראקציות במיקרו-סביבה של הגידול משפיעות על טרנספורמציה. טכניקה זו אפשרה לנו לחקור תופעות כגון EMT חלקי וזיהום HPV, יחד עם האינטראקציה שלהם עם המערכת החיסונית בביולוגיה של סרטן תאי קשקש במערכת העיכול.
