המטרה הכוללת של הליך זה, היא לשחזר את רוב ההיבטים החיוניים של מחלת פרקינסון במודל של בעלי חיים. המסירה הסטריאוטקסית של וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו, המקודדים את הסינוקליין האנושי בסובסטנטיה ניגרה. מחלת פרקינסון היא הפרעה נוירודגנרטיבית הכרוכה במוות של נוירון דופמינרגי, במסלול הניגרוסטריאלי, וכתוצאה מכך, בהתקדמות של אובדן שליטה בתנועה רצונית.
תהליך נוירודגנרטיבי זה מלווה, בתצהיר של צבירת חלבונים במוח, אשר מורכבים בעיקר על ידי סינוקלאין. עדויות חדשות מצביעות על כך שאגרגטים של סינוקלאין יכולים לעורר קולטנים דמויי אגרה על המיקרוגליה, ובכך לעורר דלקת עצבית בסובסטנטיה ניגרה. יתר על כן, עדויות מצביעות על כך שאגרגטים של סינוקלאין יכולים להיתפס ולהציגם, על ידי תאים המציגים אנטיגן לתאי T, ובכך לגרום לתגובה חיסונית נרכשת ספציפית לסינוקלאין.
ההעברה הסטריאוטקסית של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו המקודדים את הסינוקליין האנושי ב- substantia nigra, הראתה כי היא משחזרת היבטים חיוניים רבים של המחלה, כולל פתולוגיה של סינוקלאין, הפעלה מיקרוגליאלית, הפעלת תאי T, ניוון עצבי ופגיעה מוטורית. מחקר זה מציג ניתוח של האופן שבו וקטור ויראלי והזמן שלאחר מסירת וקטור ויראלי, משפיע על היקף הביטוי של הסינוקליין האנושי, ניוון עצבי ודלקת עצבית במסלול הניגרוסטריאלי, כמו גם על מידת הפגיעה המוטורית במודל עכבר של העברה סטריאוטקסית חד-צדדית של סינוקלאין אנושי בסובסטנטיה ניגרה. כדי לשמור על סביבה אספטית, לבשו בגדי ניתוח מתאימים במהלך כל הניתוח, כולל כיסויי נעליים, מסכת ניתוח, מחסום סניטרי, כפפות וכובע ניתוח.
לרסס אתנול על העכבר ועל כל החומר הניתוחי, כדי לשמור על הסביבה האספטית. כדי לגרום לשיכוך כאבים, יש להזריק קרפרופן באופן תת עורי כל 12 שעות, החל משעה לפני הניתוח, ונמשך עד שלושה ימים לאחר הניתוח. כדי להרדים את העכבר, הניחו את החיה בתא אינדוקציה.
פתחו את זרימת האיזופלורן בקצב של 0.5% ואז הגדילו אותה באיטיות עד 5% במשך כחמש דקות עד שהעכבר איבד את הרפלקס הימני שלו. הסר את החיה מתא האינדוקציה. מעבירים מיד את החיה למעגל שאינו מתרבה מחדש עם חרוט אף בגודל מתאים.
שמור על הרדמה העכבר, עם איזופלורן 1% לאורך כל זמן הניתוח. אשרו שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטה בזנבותיו ובכפותיו. כאשר העכבר אינו מגיב בעת צביטה של הזנב והכפות, משמעות הדבר היא שהעכבר מורדם לחלוטין.
לגלח את ראש העכבר באמצעות מספריים. נקו את עור העכבר באמצעות צמר גפן עם כלורהקסידין 2% והסירו את כל השיער. תקן את ראש העכבר במסגרת הסטריאוטקסית.
הניחו מגן קרנית בשתי עיני העכבר, באמצעות צמר גפן. כדי למנוע אינדוקציה של לחץ אצל מכרסמים אחרים, הימנעו מנוכחותו של כל עכבר אחר בחדר הניתוח. נקו את ראש העכבר עם שלושה סיבובים של כלורהקסידין 2% ואחריו אתנול 70% חשפו את הגולגולת באמצעות חומר כירורגי, ועשו חור דק עם מקדחה בקואורדינטות אנטרופוסטריור 2.8 מ"מ, ובינולית 1.4 מ"מ, ביחס לקו המדיאלי.
מכניסים את המחט של מזרק 10 מיקרוליטר לחור, ומזיזים את המחט בתוך המוח לאט, עד שמגיעים ל-7.2 מ"מ דורסו-גנטרלי, ביחס לדורה. השאירו את המחט במצב הסופי במשך שתי דקות, כדי לאפשר לרקמה להתיישב מעט, ולאחר מכן הזריקו מיקרוליטר אחד של וקטורים נגיפיים לתוך הסובסטנטיה ניגרה הימנית, בקצב של 0.2 מיקרוליטרים כל 30 שניות. להשאיר את המחט באותה תנוחה במשך חמש דקות לאחר המסירה של וקטורים ויראליים, ולאחר מכן למשוך אותו לאט.
סגרו את הפצע באמצעות תפר משי סטרילי. הכניסו את העכבר לכלוב הביתי, התחממו מראש על ידי הנחתו מעל מזרן חשמלי וחם. 12 שבועות לאחר הניתוח הסטריאוטקסי, להעריך את הביצועים המוטוריים, באמצעות גרסה פשוטה של מבחן הקרן, שתוארה קודם לכן.
לשם כך, יש להשתמש בקורה אופקית באורך 25 ס"מ וברוחב של 3 ס"מ. משטח הקרן חייב להיות מכוסה על ידי רשת מתכתית עם ריבועים של סנטימטר אחד, ומוגבה סנטימטר אחד מעל הקורה. הכינו סרטון של העכבר, תוך כדי חציית קרן פני השטח של הרשת, מקצה אחד לקצה הנגדי של הקורה, שם נמצא הכלוב הביתי.
לאמן את העכבר במשך יומיים, לפני קביעת הביצועים המוטוריים. ביום הראשון, לאמן את העכבר ללכת דרך הקורה חמש פעמים, ללא הרשת. ביום השני, לאמן את העכבר ללכת דרך הקורה, בנוכחות הרשת חמש פעמים.
ביום השלישי, להעריך את הביצועים המוטוריים. כדי לעשות זאת, לכמת את מספר השגיאות שבוצעו, על ידי כפות שמאל או על ידי כפות ימין בנפרד, על ידי צפייה בסרטונים במצב הילוך איטי. כדי להרדים את העכבר, להזריק תערובת של קטמין וקסילזין intraperitoneally.
ברגע שהעכבר מורדם לחלוטין, פותחים את בית החזה בחומר כירורגי, וחושפים את הלב. לאחר מכן הכנס מחט קצה שטוחה, לתוך החדר השמאלי של הלב. על ידי צימוד המחט לצינור, מנקבים 50 מיליליטרים של מלח חיץ פוספט, בקצב של 9.5 מיליליטר לדקה, באמצעות משאבה פריסטלטית.
הסר את המוח באמצעות מספריים ופינצטה, ולאחר מכן תקן אותו על ידי טבילה, בחמישה מיליליטרים של 4% paraformaldehyde, במי מלח מאגר פוספט. לאחר מכן, לשים את המוח הקבוע, ב 15 מיליליטר של 30% סוכרוז במשך 48 שעות. לאחר מכן מכניסים את המוח לארבעה מיליליטרים של תמיסת ההגנה על ההקפאה, ומצילים את המוח ב-80 מעלות, או משתמשים בו מיד בשלב הבא.
כדי להשיג פרוסות סטריאליות, חותכים את המוח למקטעים בעובי 40 מיקרומטר, החל מ-1.34 מ"מ, וסיימו ב-0.26 מ"מ. קוצרים כל פרוסה בקריוטובה של שני מיליליטרים, לפי סדר אנטרופוסטריור. כדי לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי ואימונופלואורסצנטי בסטריאטום, בחר חמישה מקטעים סטריאליים קורונליים שנלקחו במרווחי זמן אחידים, המכסים את כל היקף הרוסטרוקואודלים של הגרעין.
כדי לאמת את המסירה הנכונה של וקטורים נגיפיים בתאי העצב הדופמינרגיים של המסלול הניגרוסטריאלי, הוזרקו וקטורים המקודדים GFP, בסובסטנטיה ניגרה, ו -12 שבועות לאחר מכן, הפלואורסצנציה של GFP וטירוזין הידרוקסילאז פעילות חיסונית נותחו בסובסטנטיה ניגרה וסטריאטום על ידי אימונופלואורסצנציה. הפלואורסצנציה הקשורה ל-GFP, הייתה ממוקמת אך ורק באתר ה-ipsilateral, וקולוקליזציה משמעותית עם אימונו-פעילות חיסונית של טירוזין הידרוקסילאז נצפתה הן בסובסטנטיה ניגרה והן בסטריאטום, מה שמצביע על העברה נכונה של וקטורים נגיפיים בתאי העצב הדופמינרגיים של המסלול הניגרוסטריאלי. כדי לבחון את המינון של וקטורים, קידוד סינוקלאין נדרש, כדי לגרום לביטוי יתר משמעותי של סינוקלאין אנושי המקדם ניוון עצבי של הנוירונים הדופמינרגיים הניגרליים, הוזרקו מינונים שונים של הווקטורים.
ו -12 שבועות לאחר מכן, החיסון של הסינוקליין האנושי, ומידת האימונו-פעילות החיסונית של טירוזין הידרוקסילאז נבדקו במסלול הניגרוסטריאטלי. האימונו-פעילות החיסונית של הסינוקליין האנושי ניכרה, כאשר כל המינונים נבדקו בסובסטנטיה ניגרה. עם זאת, רק עכברים שקיבלו 10 עד 10 גנומים נגיפיים לכל עכבר, הציגו פעילות חיסונית ניכרת של הסינוקליין האנושי, בסטריאטום.
עכברים שקיבלו 10 עד 10 גנומים נגיפיים לכל עכבר של וקטורים המקודדים סינוקלאין אנושי, הציגו אובדן משמעותי של נוירונים דופמינרגיים בסובסטנטיה ניגרה. למרות שעכברים שקיבלו את אותו מינון של וקטורים המקודדים GFP, הציגו רמה נמוכה של אובדן עצבי, עכברים אלה הציגו רמה נמוכה יותר באופן משמעותי של ניוון עצבי, בהשוואה לאותם עכברים המקבלים וקטורים, המקודדים את הסינוקליין האנושי. באמצעות בדיקת הקרן, הפחתה משמעותית בביצועי המנוע זוהתה באופן בלעדי באותם עכברים, וקיבלה 10 עד 10 גנומים נגיפיים לכל עכבר של וקטורים המקודדים את הסינוקליין האנושי, כאשר משווים את מספר השגיאות שנעשו על ידי הכפות הימניות והשמאליות, או כאשר משווים את המספר הכולל של השגיאות, של עכברים המקבלים וקטורים המקודדים את הסינוקליין האנושי, עם העכברים האלה שמקבלים את וקטור הבקרה.
כדי להגדיר את הופעת ביטוי הסינוקליין האנושי, העכברים טופלו ב-10 עד 10 גנומים נגיפיים לכל עכבר, של וקטורים המקודדים סינוקלאין אנושי, או ניתוח בושה, ומידת הביטוי של הסינוקליין האנושי נותחה ב-substantia nigra, פעם בשבוע, במהלך שבועות שניים עד חמישה לאחר הניתוח הסטריאוטקסי. התוצאות מראות כי ביטוי הסינוקליין האנושי החל להיות ניכר בשבוע החמישי לאחר הניתוח הסטריאוטקסי. כדי לקבוע את שיא ההפעלה המיקרוגליאלית, היקף התאים המבטאים רמות גבוהות של Iba1, כומת בסטריאטום של עכברים, במהלך שבועות 2-15 לאחר הניתוח.
התוצאות מראות עלייה משמעותית בהפעלה המיקרוגליאלית של הצד האיפסילטרלי, בהשוואה לצד הקונטרה-צדדי של העכברים, 15 שבועות לאחר החיסון הנגיפי. מספר תאי ה-T הרגולטוריים שחדרו לתוך הניגרה המשמעותית נותח בנקודות זמן שונות, לאחר הניתוח הסטריאוטקסי על ידי אימונופלואורסצנציה, ולאחר מכן תצפית מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיא חדירת תאי T רגולטוריים לתוך הסובסטנטיה ניגרה נצפה בשבוע 11 לאחר הניתוח.
מודל העכברים של ניוון עצבי שנותח כאן, מייצג מודל שימושי לחקר מספרים של מעורבות היבטי מפתח בפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון. מנגנוני המעורבות המעורבים בפתולוגיה של הסינוקליין, בהפעלה מיקרוגליאלית, במעורבות של מערכת החיסון ההיקפית, בדלקת עצבית ובמנגנוני הניוון העצבי מינון תקין של וקטור ויראלי הקשור לאדנו, תת-סוג 5 המקודד סינוקלאין אנושי כדי לגרום לניוון עצבי, דלקת עצבית, חדירה לתאי T ופגיעה מוטורית, הוא 10 עד 10 גנומים נגיפיים לכל עכבר. מחקר זה מראה, כי חמישה שבועות לאחר הניתוח הסטריאוטקסי, מהווה נקודת זמן מרכזית, שבה ביטוי הסינוקלין האנושי כבר ניכר, אך בהיעדר פגיעה מוטורית במודל חייתי זה.
לפיכך, נקודת זמן זו, מייצגת נקודה זמנית מעניינת, להתחיל את מתן הטיפולים הניסוייים המותאמים לעצירת ההתקדמות של דלקת עצבית וניוון עצבי. נקודת הזמן המתאימה ביותר לניתוח דלקת עצבית במודל חייתי זה, היא בשבוע 15 לאחר ניתוח סטריאוטקסי. בעוד נקודת זמן נכונה לניתוח חדירת תאי T למערכת העצבים המרכזית.
נראה שהוא בשבוע 11 לאחר חיסון וקטור ויראלי.
