הערכה של מספר נוירון דופאמין הסובסטנציה ניגרה הוא מדד תוצאה מרכזי במחקר מחלת פרקינסון. פרוטוקול זה מקצר באופן משמעותי את עומס העבודה הנדרש להערכת מספר הנוירונים. שיטה זו מספקת תהליך יעיל ומדויק לגילוי שינויים במספר הנוירונים הדופאמינרגיים ומתאימה לקביעת ההשפעה של התערבויות על הישרדות התאים.
שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לספק ספירות מדויקות של נוירונים באזורי מוח שונים תוך שמירה על עלות ויתרונות זמן על פני שיטות סטריאולוגיות מסורתיות. כדי ללכוד תמונות IHC להשתמש בתוכנה יחד עם מיקרוסקופ confocal בהגדלה 10X. פתח את חור הסיכה ל-1.5 יחידות שטח כדי ללכוד מישור רחב בהיקף של 1.5 מיקרו מטרים ולהתמקד בצד המוזרק של המוח.
בכרטיסיה רכישה בדוק את אפשרות הדמיית סריקת האריחים והגדר את הממדים ל- 10 על 4. תחת החלונית 'מצב רכישה' הגדר את גודל התצוגה ל- 1.1 כדי למנוע סימני תפירה בין תמונות סריקת האריחים. הגדר את גודל המסגרת ל- 1024 על 1024 פיקסלים ואת הממוצע לשניים כדי להבטיח רכישת תמונה באיכות גבוהה.
בלוח הערוצים להגדיר מסלול אחד אלקסה 488 ומסלול שני אלקסה 555. טען את השקופית על הבמה ובחר מקטע עם כתמי TH חזקים. לחץ על בשידור חי על לוח הרכישה.
בלוח הערוצים להגדיר את עוצמת הלייזר ולהשיג לרמות למקסם את האות ולהגביל את רעשי הרקע. השתמש במחוון הטווח כדי לוודא שהאותות אינם נחשפו יתר על ה-כך. חזור על פעולה זו עם שקופיות מרובות.
בכרטיסיה רכישה, סמן את התיבה מיקומים. כדי להתחיל בהדמיה, השתמש בחתיכת העין ובחר את החלק הראשון המציג כתמי TH חיוביים. לאחר מכן הגדר את המוקד בנקודת העניין והזז את הבמה לקו האמצע של המקטע.
פעולה זו שומרת את המיקום בצירים X, Y ו- Z ותדמיין סריקת אריח הלוכדת את המקטע כולו. חזור על פעולה זו עבור כל השקופיות האחרות, כולל אתר שאינו מוזרק. הפרד קבצי תמונה באמצעות התוכנה המתאימה וייבא אותם לתוכנת ניתוח תמונה אוטומטית.
הגדר אזור מעניין על-ידי בחירה בכלי ביאור העט כדי לצייר ביאור סביב הסובסטנציה nigra pars compacta. עבור לכרטיסיה ניתוח ובחר כוונון בזמן אמת מתפריט הניתוח הנפתח. פעולה זו פותחת חלון נפרד בתמונת המקטע המאפשר שינוי בזמן אמת של פרמטרי ניתוח.
תחת מקטע הגדלת הניתוח, בחר את גודל התצוגה המתאים של התמונה. תחת סעיף זיהוי התא לבחור צבע גרעיני כמו הצבע המשמש כתמי TH. התאם את סף הניגוד הגרעיני, העוצמה הגרעינית המינימלית, תוקפנות הפילוח הגרעיני והגדרות הגודל הגרעיני תוך התבוננות קפדנית בחלון כוונון הזמן.
חזור על תהליך זה עם דוגמאות מרובות. לאחר שנדגמו מספר מתאים של תמונות והכוונון בזמן אמת הותאם בהתאם, שמור את הגדרות הניתוח בתפריט הנפתח של פעולות ההגדרות. בחר את כל התמונות שיש לנתח ולחץ על לנתח.
בחר את הגדרת הניתוח שנשמרה זה עתה ובאזור חלון הניתוח בדוק את תיבת שכבות הביאור ולאחר מכן בדוק את שכבה 1 ולחץ על נתח. לאחר השלמת הייצוא של נתוני ניתוח הסיכום עבור כל המקטעים על-ידי בחירה באפשרות לייצא נתוני ניתוח אובייקטים. ערכת נתונים זו יכולה לשמש לבדיקת שינויים בגודל התא בתגובה לרעלן או טיפולי.
שישה שבועות לאחר אדנו הקשורים וירוס או זריקות AAV, הזרקה סטריאוטקטית של AAV המביע מוטציה A53T אלפא synuclein לתוך הסובסטנציה ניגרה במוח החולדה הביא לירידה משמעותית בצפיפות של נוירונים דופאמין. המספר הממוצע של נוירונים חיוביים TH למילימטר בריבוע הסובסטנציה ניגרה של חולדות מוזרק עם AAV-A35T ירד באופן משמעותי בהשוואה לזה של חולדות מוזרק עם וקטור ריק AAV. תצפיות דומות נעשו באמצעות סטריאולוגיה לא משוחדת.
בעת ניסיון פרוטוקול זה יש לזכור את התוכנה היא שימושית רק כפי שהוא מאומן להיות. לכן יש לנקוט בזמן ובזהירות כדי להבטיח שתא בודד מזוהה כתא יחיד. התוכנה יכולה להיות מותאמת כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של חלבונים אחרים של תחומי עניין כגון אלפא-synuclein כדי לקבוע אם טיפולים יכולים לווסת את רמות החלבון.
טכניקה זו אפשרה יעילות רבה יותר בעת בדיקת ההשפעה של טיפולים פוטנציאליים מרובים על צפיפות נוירון דופאמין.
