פרוטוקול זה יתווה דרך קלה ויעילה לבודד בהצלחה תאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים ברשתית של עכברים. תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית ממלאים תפקיד חשוב מאוד בשמירה על תאי הפוטורצפטור ולהבטיח את תפקודה התקין של הרשתית. המעבדה שלנו מבודדת תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של עכברים ככלי חשוב לחקר מחסום הדם-רשתית החיצוני ומחלות קשורות כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל.
כדי לחלץ את עיני העכבר, יש להרדים את העכבר באופן אתי בהתאם לשיטות המאושרות על ידי המוסד שלך, לאחר מכן להניח את העכבר על משטח תחתון סטרילי ולהניף את העין על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזה, ואז להזיז את הפינצטה לחלק האחורי של העין ולמשוך בעדינות כדי להסיר את העין ולוודא שעצב הראייה עדיין שלם. בעת שימוש במלקחיים, טבלו את העיניים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל 5% יוד פובידון. לדגור את העיניים בטמפרטורת החדר במשך 2 עד 3 דקות.
הסר את העיניים מן יוד povidone ומניחים אותם בצלחת פטרי. בעת שימוש פיפטה העברה סטרילית, לשטוף את העיניים עם תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced עד הצבע הכתום של יוד פובידון נעלם. זה לוקח בערך 2 עד 3 כביסות.
הניחו את העיניים בצלחת פטרי חדשה וטבלו אותן במדיית גדילת תאי RPE מלאה וקרה. משם, אתה יכול להתחיל לנתח תחת מיקרוסקופ לנתח. מתחת למיקרוסקופ, השתמש בפינצטה ו/או במספריים של Vannas כדי למשוך או לחתוך רקמת חיבור בשרירים חוץ-עיניים.
לאחר מכן ניתן להחזיק את העיניים במשך שעה במדיה של תרבית תאי RPE קרה. עם זאת, עדיף להמשיך ישירות לשלב הבא לאחר ניקוי גלגל העין. מעבירים את העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מיליליטר המכיל את האנזים A תמיסה, ואז דוגרים את העיניים בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
הסר את העיניים מתמיסת האנזים A והנח אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מיליליטר המכיל את תמיסת האנזים B, ולאחר מכן הנח אותן בתוך אינקובטור ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. הסר את העיניים מהאנזים B והנח אותן בצלחת פטרי של 60 מילימטר וטבל אותן והשלם את מדיית הצמיחה של תאי RPE, ולאחר מכן דגירה של העיניים ב -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מניחים את התבשיל מתחת למיקרוסקופ המנתח ומתחילים לנתח.
השתמש מלקחיים M5S ומחט של מזרק כדי לבצע חתך בקטע ora seratta. עכשיו עם שני מלקחיים, לתפוס את החלק הפנימי של החתך עם מלקחיים אחד ולתפוס את הקרנית עם הכוח השני. מתחילים לקרוע באיטיות את הקרנית מהרשתית על ידי משיכת הקרנית.
הקפידו לקרוע במרווחים קטנים ולעבור במורד הקרע כשאתם מסירים את הקרנית. זה יבטיח כי RPE יישאר בעיקר שלם ואתה תקבל קרע נקי יותר. ברגע שהקרנית מנותקת לחלוטין, אתה אמור להיות מסוגל לראות את הקשתית והעדשה.
הסר הן את הקשתית והן את העדשה עם מלקחיים כדי לשמור על טוהר הבידוד. כדי להסיר את הרשתית העצבית משכבת ה-RPE, תפסו את השכבה החיצונית של העין בפינצטה אחת והניחו זרוע של פינצטה שנייה בין ה-RPE לשכבה העצבית. משם, משכו בעדינות או הוציאו את הרשתית העצבית הרחק משכבת ה-RPE, ולאחר מכן השליכו את הרשתית העצבית.
הזיזו את שכבת ה-RPE למקום אחר על המנה ללא לכלוך. כדי להפריד את ה-RPE מהכורואיד והסקלרה, יש לגרד בעדינות את החלק הפנימי של ה-EYECUP בעזרת פינצטה בסגנון 5/45 כדי להבטיח את הפרדת תאי ה-RPE. תאי ה-RPE נראים מעוננים כאשר הם מושעים ומדיית הצמיחה המלאה של תאי RPE.
שאפו את התאים באמצעות פיפטה סטרילית של 3.2 מיליליטר והעבירו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר המכיל מדיה מלאה לצמיחת תאי RPE. התאים יכולים להיות צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן תוכל לשאוף החוצה את הסופר-נטנט ולהשהות את הכדור במדיית גידול תאי RPE מחוממת.
צלחת את התאים על צלחת פטרי 100 מ"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. תמונות אלה מראות בידוד מוצלח במעבר 0 ובמעבר 1, אשר ניכר על ידי פיגמנטציה של תאי RPE. במעבר 4, התאים הופכים פחות אופייניים ומפגינים פחות פיגמנט, מראים מראה דמוי ציר או הופכים לחזקים יותר עם שטח פנים גדול יותר.
אימתנו את תאי ה-RPE באמצעות סמן ספציפי ל-RPE, RPE65 וחלבון ציטוסקטלי F-אקטין. בדקנו גם זיהום פוטנציאלי בתאי מולר על ידי צביעה בסמן ספציפי לתא מולר, וימנטין. פרוטוקול זה הוא התאמה פשוטה של פרוטוקולים קיימים.
הפרוטוקול משתמש בחומרים ובציוד נלווה הזמינים ברוב מעבדות המחקר, מה שיסייע לבודד תאי RPE ראשוניים של עכברים בצורה יעילה.
