Name: primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן BrightFocus (ל- DS).

הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת פיטסבורג
1. מכינים פתרונות
<ol><li>להכין את מדיום הגידול על ידי וחדשניות Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), גלוקוז גבוהות עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2.5 מ מגלוטמין ו 1 x MEM שאינן חיוניות חומצות אמינו. לחמם את המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.</li>
	<li>להכין 2% (wt/כרך) dispase II הפתרון עובד:<ol>
<li>להכין פתרון מניות של 100 מ"ג/מ"ל dispase השני על ידי המסת 30 מ"ג של dispase השני בתוך 300 µL HEPES באגירה תמיסת מלח (50 מ מ HEPES/קו pH 7.4, 150 מ מ NaCl). אמצעי אחסון זה עבור 3-4 עכברים, שניתן יהיה גודלו או למטה בהתבסס על מספר עכברים לניסוי). מלאי זה ניתן לאחסן לפחות שבוע 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להכין הפתרון עובד של 2% dispase על-ידי הוספת µL 300 של 100 מ"ג/מ"ל dispase II המניה 1.2 מ של DMEM סטרילי, גלוקוז גבוה וסינון הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22. שלב זה יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים. לחמם את dispase מוכן II ב- 37 מעלות צלזיוס החממה לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קבלת בעיניים העכבר
<ol><li>המתת חסד העכבר באמצעות כל שיטה שאושרו ומניחים אותו על רכיב pad סופג.</li>
	<li>לבש כפפות, לשים באגודל ובאצבע סביב העין, דחף בעדינות את העור כדי proptose גלגל העין.</li>
	<li>הוסף את קצה מספריים בזווית שבין העור של גלגל העין, בזהירות לחתוך את העין. כדי למנוע זיהום, בקצרה לטבול את העין ב-70% אתנול.</li>
	<li>מיד במקום העין ב באגירה פוספט מלוחים (מגניב) בצלחת פטרי.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.2-2.4 כדי להסיר את העין השנייה.</li>
</ol>3. עין לנתיחה
<ol><li>בזהירות הסר רקמת העין תחת המיקרוסקופ ויבתר. זה יכול להיעשות PBS או על הפטרי יבש.<ol>
<li>להשתמש מלקחיים הפתולוגיים כדי להרים את רקמות החיבור של גלגל העין, לגזור אותם באמצעות מספריים Vannas. Not גזור את sclera כי זה כמעט בלתי אפשרי להשיג את eyecups האחורי שלם אם חותכים את sclera.</li>
		<li>לאחר ניקוי רקמת חיבור, לשמור את העיניים וכתוצאה מכך ב- PBS לשלב הכביסה הבא. הערה: כל השלבים הבאים יש לבצעו בזרם שכבתית ארון בתנאים סטריליים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את העיניים פעמיים ב מראש ומחוממת 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה). להעביר בזהירות את העיניים לתוך ומחוממת מראש 37 ° C DMEM (גלוקוז גבוהה) באמצעות מלקחיים. מחוק לגמרי את העיניים בינוני והעברת לבינונית טריים בקערה חדשה.</li>
	<li>האחות DMEM (גלוקוז גבוהה) בינוני, דגירה העיניים שבה הפתרון עובד II ומחוממת מראש dispase 2% (wt/כרך) למשך 45 דקות בחממה 37 º C. הערה: בתוך כל השלבים הבאים, במקום ולטפל עיניים או eyecups במצע הגידול, אשר להגן על הרקמות, לספק מדיום טוב הקרע.</li>
	<li>הסר את הפתרון השני dispase, לשטוף את העיניים פעמיים בתוך מדיום הגידול על-ידי כ רפה בעברית המדיום הישן והוספת מדיום הגידול מראש ומחוממת-37 ° C החדשה (איור 1 א'). הערה: לאחר דיסוציאציה מאת dispase II, העיניים הופכים רכים.</li>
	<li>. תחזיק את העין עם מלקחיים, בחתך סביב serrata אורה של כל עין בעזרת מספריים Vannas תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון.<ol>
<li>שמירה על גלגל העין בפתרון, הסר בזהירות הקרנית הקדמי על ידי הרחבת החתך סביב המעגל serrata אורה ומושך הקרנית הקדמי משם אחרי החתך כבר מלאה.</li>
		<li>הסר עדשה כמוסה של איריס המשויך פיגמנט האפיתל על ידי בעדינות משיכתן אל מחוץ עיינית עם מלקחיים teethed (איור 1b, 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה של eyecups אחורי שנוצר במצע הגידול למשך 20 דקות ב 37 ° C כדי להקל על הפרידה של הרשתית עצבית RPE.</li>
	<li>חותכים את eyecups אחורי 4 עלי כותרת מתחת למיקרוסקופ ויבתר להציב את זרימה שכבתית בארון. החתכים צריך להיות מספיק זמן לשטח את עיינית, אבל קצר מספיק כדי לשמור על הכותרת מחוברים (איור 1 d).<ol>
<li>לרדד את עיינית ולהסיר את הרשתית עצבית על ידי בעדינות משיכתו עם מלקחיים תוך החזקת הנותרים RPE-שכבה דמית-בסקלרה מתחם עם מלקחיים אחר (איור 1e). התחילו למשוך מהקצוות, ולא מן המרכז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העברת שכל רקמות חתוכות לרבעים לתוך תבשיל תרבות סטרילי חדש מלא מראש חימם מדיום הגידול 37 º C.</li>
</ol>4. בידוד תאי RPE ראשי
<ol><li>מחזיקים עלה כותרת אחד של המתחם RPE-שכבה דמית-בסקלרה חתוכות לרבעים עם בסדר סופר מלקחיים, לקלף בעדינות בין יריעות RPE. ללא פגע מן קרום המרתף המשמש כבסיס (הממברנה של ברוך) באמצעות סכין סהרון המיקרוכירורגית תחת המיקרוסקופ ויבתר להציב אותם זרימה שכבתית cabinet (איור 1f).<ol>
<li>להעביר את הסדינים RPE לתוך המנה סטרילי תרבות חדשה המכילה מדיום הגידול על-ידי שימוש micropipette P200. בעת העברת גליונות RPE, להרטיב את הטיפים פיפטה עם מדיום הגידול על-ידי pipetting מספר פעמים כדי למנוע רקמת נשאר בפנים הטיפ. RPE יהיה ניתן להבחנה ברורה מן דמית העין: RPE נראה יותר חום, בעוד שכבה דמית כהה יותר, נראה דביק ורך.</li>
		<li>לחלופין, השתמש עיכול אנזימטי דיסוציאציה עדין ללא מלקחיים כדי לנתק את RPE מן דמית העין14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לכבס את המצעים RPE 2 - 3 פעמים באמצעות מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מדיום הגידול בצלחת תרבות סטרילי. לאחר כל שלב כביסה, בזהירות לאסוף את הסדינים RPE תוך הימנעות לרקמות אחרות כגון פסולת הרשתית או דמית העין. בסוף בכביסה האחרונה לאסוף את הסדינים RPE עם micropipette P200 ולמקם אותם בצינור microcentrifuge של 1.5 mL החדש. הערה: יש צורך centrifuge את הסדינים RPE: הם יהיו משקעים על ידי הכבידה בתוך 1 דקות.</li>
	<li>הסר את מדיום הגידול הנוסף באמצעות micropipette P200. Resuspend התאים מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים, בעדינות triturate אותם באמצעות micropipette P200. למנוע היווצרות בועות. השעיה תא בודד הוא אידיאלי, אך גם להימנע trituration מדי, אחרת תאי RPE אינם מסוגלים לשרוד. אנו ממליצים מאוד בעדינות trituration 40 - 50 פעמים.</li>
</ol>5. culturing תאי RPE
<ol><li>צלחת את התאים על צלחת תרבות.<ol>
<li>אם יישומים במורד הזרם של תאי RPE דרוש לשמירת הקוטביות שלהן, צלחת RPE תאים של עכברים 2 ב 12 מ מ אחד ממברנה פוליאסטר הוספה טעון מראש ב 12-ובכן תרבות צלחות. ציפוי התאים-צפיפות גבוהה רצוי כי במקרה זה תאי RPE מסוגלים לשמור את המאפיינים המקוריים, כגון צורת משושה פיגמנטציה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אין להעביר את הצלחת או לשנות את מדיום הגידול עבור ה 72 הראשון של culturing. לאחר 3 ימים, החלף את המדיום הישן עם מדיום הגידול מראש ומחוממת טריים. לאחר מכן לשנות את המדיום תרבות בכל יום אחר. ברגע תאי RPE confluency, להפחית את FBS במדיום גידול ל- 2%. הערה: התאים ניתן לפצל באמצעות טריפסין 0.25%. עם זאת, לאחר פיצול התאים עלול לאבד שלהם צורת משושה, פיגמנטציה, הקטעים הבאים. אנו לא ממליצים פיצול התאים, אך אם הדבר נדרש על-ידי היישומים במורד הזרם של התרבות, עליך לזכור כי התאים ראשי לא יכול להיות passaged ללא הגבלת זמן: הם ידועים דה-להבדיל לאחר 5-7 קטעים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mart&#237;nez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development:+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium.">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li><li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells:+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations.">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li><li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium.">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li><li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells.">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li><li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models.">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li><li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+(RPESC).">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li><li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+culture;a+potential+source+of+retinal+stem+cells.">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li><li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes.">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li><li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling.">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li><li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin,+complex+1+signaling.">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li><li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

DS קיבל מחקר מימון Bayer HealthCare, גרמניה ו פ הופמן-La Roche, שוויץ. המחברים הנותרים להכריז אין אינטרסים כלכליים מתחרים. עבודה זו נתמכת על ידי מחקר כדי למנוע עיוורון (מוגבל מענקים וילמר העין המכון, אוניברסיטת פיטסבורג).  עבודה זו נתמכת גם כספים סטארט-אפ ל DS עיניים, אוניברסיטת פיטסבורג.

פרוטוקול מפורט הציג מאפשרת הקמת אמין של העכבר הראשי תרבויות RPE להגיע confluency לאחר שבוע 1, להציג את מאפייני RPE העיקריים כגון צורת משושה פיגמנטציה לאחר 2 שבועות. תאי RPE שהושג יכול לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון חילוף החומרים ויטמין A9, phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור<sup class="xref...

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) היא שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. הפונקציונליות של תאי RPE ויושר טפט RPE הם קריטיים עבור חזון כי RPE ממלא תפקיד חשוב בתהליכים מרובים כגון שמירה על המחסום דם-רשתית החיצוני, הובלת מים, יונים בין הרשתית ו מקלעת דמית העין, אור הקליטה, הגנה מפני סטרס חמצוני, שליטה על חילוף החומרים retinoid, phagocytosis המקטעים החיצוני של1,photoreceptors2. המיקום של RPE מאחורי העין, וכן תפקידה מחסום מניעת סמים מנוהל מערכתית עובר מהדם אל נוזל, להקשות ללמוד את המורכבות של ה RPE פונקציה ויוו. לפיכך, יש צורך גדול להקמתה של תרביות תאים RPE ללמוד תאי RPE גמיש, בסביבה מבוקרת3,4.
מספר קווי תאי RPE הוקמה קיימות, מתן דרך קלה ונוחה של קבלת ואחסון של התאים; עם זאת, תאים passaged יש כמה חסרונות לעומת תאים ראשי-2,-3,-4. ראשית, הם לעיתים קרובות מאופיינים על ידי שינויים מורפולוגיה תאים. לדוגמה, אף אחד ממחקרי התא הקיימים נמצאו בהכשרת מחקר אמין של המאפיינים מכשול RPE בשל האובדן של פנוטיפ קוטביות תא והעלמות חלקית של צמתי צר4. בנוסף אובדן קוטביות והתקשרויות לתא המתאים, הקווים תאי RPE לאבד במהירות שלהם פיגמנטציה בשל היעדרם של אנזימים melanogenesis מפתח ב RPE למבוגרים5. ניתן לשחזר את הפיגמנטציה, אבל ניתוח מקיף של המנגנון של פיגמנטציה מחדש אשר כוללים שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, ג'ין ביטוי מבחני ניתוח וכימיקלים לאשר הנוכחות של מלנין מעולם כבר בביצוע6. מגבלה אחת יותר הוא הקווים תאי RPE חיי תאים המורחבת (לפעמים - אלמוות), בתנאים מסוימים יכול להפוך עצמי המתחדש תאי גזע multipotent כי ניתוק מן המצע טופס צף מושבות7, 8. מגבלה זו עושה את זה בלתי אפשרי להשתמש הקווים תא עבור השתלת ניסויים3.
בהתחשב החסרונות של הקווים תאי RPE הוקמה העיקרי תרביות תאים RPE המתקבל רקמות טרי עשוי לשמש מודל יותר ביולוגית רלוונטית ללמוד את RPE. ראשי תאי RPE שימשו לא רק ללמוד פונקציות ייחודיות RPE כגון ויטמין A חילוף החומרים9, phagocytosis של קולט אור מקטעי החיצוני10 ויון תחבורה11, אלא גם ללמוד ביולוגיה של התא בסיסיים כגון אפיתל התא קוטביות2 , הומאוסטזיס lysosomal autophagy12,13.
בחודשיים האחרונים של שנים היו מספר פרסומים על ביסוס ראשוני RPE תרבויות, המציין עניין הולך וגובר באזור זה של מחקר3,14,15. פרוטוקולים רבים עבור תאי RPE אדם ותאים RPE אנושיות כגון תאי RPE שור וחזירי היו שפורסמו16,17,18,19. עם זאת, קשה יותר להתמודד עם תאי RPE העכבר בשל גודלם קטן בהרבה. אף-על-פי מספר פרסומים תיארו פרוטוקולים בידוד תאי RPE העכבר14,20,21, עדיין ישנם חוקרים רבים נאבקים לבודד תאי RPE ללא זיהום של תאים דמית העין או תאים מפני פסולת עצבי הרשתית. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי RPE תרבית תאים, לרבות קבלת העיניים של העכבר, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. פרוטוקול וידאו זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים שמתחילים לעבוד עם העכבר הראשי RPE תרבויות, צריכים הדרכה על הטכניקות לנתיחה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי מקוטב מאוד הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. . זה גיליון אחד של תאי פיגמנט hexagonally ארוז, המחוברים באמצעות צמתי צר... הפונקציות העיקריות של RPE כוללים ספיגת אור, phagocytosis מקטעי החיצוני של קולט אור המחסן, אגירה המרחבי של יונים, הובלה של חומרים מזינים, יונים, מים, כמו גם מעורבות פעילה במחזור חזותי. עם כזה פונקציות חשובות ומגוונות, חשוב באורח קשה ללמוד את הביולוגיה של תאי RPE. מספר קווי תאי RPE הוקמו; עם זאת, תאים passaged מונצחים ידועים במהירות לאבד חלק מאפיינים פיזיולוגיים מורפולוגיים של תאי RPE טבעי. לפיכך, ראשי תאים מתאימים יותר ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של התא RPE ותפקוד. תרבית תאים RPE העיקרי של העכבר הוא שימושי מאוד עבור חוקרים מאז מודלים העכבר נמצאים בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים, אולם איסוף RPE תאים מן העכבר גם מאתגר מאוד בשל גודלם הקטן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת תרביות תאים RPE העכבר הראשי הכוללת העקירה, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. שיטה זו מאפשרת שחזור היעילה תא. תאי RPE המתקבל שני עכברים יכולים להגיע confluency על אחד הוספה ממברנה פוליאסטר של 12 מ מ, טעון מראש בצלחת תרבות לאחר שבוע של תרבות להציג חלק מהמאפיינים המקוריים של RPE בתום תאים כגון צורת משושה, פיגמנטציה לאחר שני שבועות של תרבות.

העכבר הראשי RPE התרבות נוצרו מ- 2 עכברים ב 12 מ מ ממברנה פוליאסטר הוספה מגיע ל 90-95% confluency לאחר שבוע 1 בתרבות. לאחר 2 שבועות של תרבות, התאים הגיעו 100% confluency והתחלתי ליצור פסיפס של תאים משושה, פיגמנט ו- bi-nucleated. על ידי 3 שבועות של תרבות, התאים המשיך כדי ליצור את הצורה והסגנון של פיגמנטצ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

21.0K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

Video: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neuroscience

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

אפיון ודינמיקה מורפולוגית של RPE מורין ראשוני מתורבת

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

מחבר זרקור: בידוד יעיל של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים מעכברים בוגרים לחקר רטינופתיה

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה