פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל תובנה רבה יותר על הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים. פרוטוקול זה מתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים משני הקשרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, תהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכים עובריים שעברו תרבית של עכברים. זה הכרחי לנוע במהירות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על קרח ולהשתמש במעכבי פוספטאז בכל מאגרי הליזיס כדי לשמור על שלמותם של חלבונים זרחניים.
כדי להתחיל, הניחו את גוף העכבר על לוח ניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, וריססו את בטן העכבר ב-70% אתנול. לאחר מכן פתח את חלל הבטן על ידי צביטה והרמת העור הקדמי לפתח הנרתיק עם מלקחיים ישרים של Semken. לאחר מכן, חתכו את העור המורם בשכבות תחתיות עם מספריים כירורגיים בעלי להב ישר בזווית של 45 מעלות משני הצדדים כדי ליצור צורת V המשתרעת על כל משטח רוחבי בערך באמצע הדרך בין ארבעת הגפיים והגפיים האחוריות.
באמצעות מלקחיים Semken, לאחוז באחת הקרניים הרחם ולחתוך מתחת oviduct ומעל צוואר הרחם עם מספריים כירורגיים. כדי לאפשר הסרה מלאה של קרן הרחם, חתכו את המסומטריום, ואז העבירו את קרן הרחם המנותקת ל-10 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. באופן דומה, הסר את קרן הרחם השנייה בצד הנגדי של חלל הבטן.
לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי באורך 10 ס"מ המכילה את שתי קרני הרחם על קרח. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, נתחו בזהירות כל עובר מקרני הרחם עם מלקחיים עדינים של דומונט 5. ואז לאט לאט למשוך את המיומטריום, את ההחלטה ואת הכוריאון.
לאחר מכן, קרעו והסירו את האניון השקוף יחסית המקיף את העובר ונתקו את חבל הטבור המחבר את העובר לשליה. לאחר מכן העבירו כל עובר מנותח ל-2.5 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בבאר בודדת של צלחת תרבית תאים בת 12 בארות על קרח באמצעות צינור העברת פלסטיק חתוך. הכינו שלוש צלחות פטרי באורך 10 ס"מ המכילות 10 מיליליטרים של PBS היסטולוגיים ושמרו אותן על קרח לשימוש בסיבוב בין עוברים.
לאחר מכן העבירו עובר אחד מבאר בודדת של צלחת תרבית התאים בת 12 הקידוחים לאחת מצורות פטרי באורך 10 ס"מ עם היסטולוגיה PBS על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה. תחת מיקרוסקופ הניתוח, הפרד כל תהליך מקסילרי מהפנים באמצעות המלקחיים העדינים על ידי ביצוע תחילה חתך בצד הקדמי של תהליך מקסילרי אחד לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין תהליך האף הלטרלי בתהליך המקסילרי בתהליך המקסילרי. לאחר מכן, חותכים את הצד האחורי של התהליך המקסילרי לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין התהליך המקסילרי לבין התהליך המנדיבולרי.
לאחר מכן הפרד לחלוטין את התהליך המקסילרי על ידי ביצוע חיתוך אנכי מהצדדים הקדמיים לאחוריים של התהליך המקסילרי בצד העין של התהליך המקסילרי שבו ההזחות הטבעיות המוזכרות לעיל מסתיימות. באמצעות פיפטת פסטר של תשעה אינץ' עם נורת לטקס קטנה של שני מיליליטר, מעבירים את זוג התהליכים המקסילריים המנותחים בטיפה קטנה של כ-30 מיקרוליטרים של PBS היסטולוגי לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על קרח. לאחר מכן העבירו את זוג רקמות התהליך המקסילרי לצינור מיקרו-צנטריפוג מסומן של 1.5 מיליליטר על קרח באמצעות פיפטת פסטר, ובכך למזער את העברת ההיסטולוגיה PBS.
יתר על כן, הסר כל עודף היסטולוגיה PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם פיפטה פסטר. הוסיפו 0.1 מיליליטר של חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח. ואז פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter.
לאחר מכן, מערבולת למשך 10 שניות, ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter, תוך הימנעות יצירת בועות. דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים תוך כדי סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור. לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר.
ראשית, שאפו את המדיום מתאי המזנכים הפאלאטאליים העובריים של העכבר באמצעות פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחוברת למערכת ואקום. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS תרבית רקמה קרה כקרח ולהטות את הצלחת הצידה במהלך הכביסה האחרונה כדי להבטיח שכל תרבית הרקמה PBS שואפת. לאחר מכן, הוסיפו חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח כדי ליזום את התאים.
דוגרים את הצלחת על קרח במשך חמש דקות עם סיבוב בערך כל דקה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת. לאחר מכן מגרדים את התאים מהצלחת באמצעות מרים תאים מקורר מראש, ומעבירים את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג' 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. לאחר מכן, דגירה של מתלה התא בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור.
לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר. ניתוח כתמים מערביים של ליסאטים של תאים שלמים מתאי מזנכים פאלטליים עובריים של עכברים מונצחים בעקבות גירוי עם ליגנד PDFG-B בין 2 ל-15 דקות חשף רצועות משוחזרות שונות עבור פוספופרוטאינים הפועלים בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה. עלייה בעוצמות רצועת הפוספופרוטאין נצפתה עם טיפול עם גורם גדילה בהשוואה לאלה של תאים לא מטופלים, בעוד שעוצמות רצועת החלבון הכוללת היו שוות יחסית בין הדגימות.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד הפרעות וזרחון משפיעות ישירות על איתות בין-תאי, ביטוי גנים ופעילות תאית בהקשרים קרניופציאליים.
