This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.

שימוש בבעלי החיים כדלקמן הנהלים המפורטים בפרוטוקול M / 11/181 אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת שימוש עבור גו. עכברי CD1 או CBA / BL6 נרכשו מיצרנים מסחריים וחצו במתקן החיה ונדרבילט להשיג עכברים בילוד. 1. הכנת עכברים, פתרונות מניות, וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צלב העכבר: להגדיר צלב עכבר ולהקליט את תאריכי חיבור על מנת לסייע בתכנון ניסוי. עכברי CD1 בדרך כלל ללדת סביב יום 19 לאחר ההזדווגות. השתמש CD1 או CBA / BL6 חוצה להשיג CD1 או CBA / BL6 בילודים, בהתאמה. Intercrosses בין שני הקווים לנצל נקבות CD1 ו CBA / זכרי BL6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מניות collagenase: לשקול IV סוג collagenase 200 מ&quot;ג עם מאזן דיוק גבוה. מעבירים צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. ממיסים ב 40 מ&quot;ל HBSS עם Ca 2 + / 2 + Mg (1.26 ו -0.5 מ&quot;מ, בהתאמה) כדי להפוך פתרון מניות 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר collagenase כדילפזר עבור ~ 30 דקות עם רעד עדין. Aliquot ולשמור הפתרון קפוא -20 ° C כמניות, אשר נשאר פעיל במשך לפחות שנה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי לעקר כמה זוגות של פינצטה, מספריים, וטיפים P20 לנתיחה קטיף איון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המניות גלוקוז 1 M: לשקול גלוקוז 9 גרם צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל, להוסיף 50 מ&quot;ל RPMI 1640 מדיה לפזר את הסוכר. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, אך לא יותר מ -6 חודשים. </li></ol> 2. פתרונות עבודה הערה: היום של בידוד איון, להכין את ריאגנטים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת הפתרון עובד מסוג IV collagenase: הפשרה לדלל מניות collagenase על קרח. לוותר 0.15 מ&quot;ל המניות לתוך כל צינור 1.7 מ&quot;ל microfuge. להוסיף 1.35 מ&quot;ל HBSS עם Ca 2 + / Mg 2+. להפוך את הצינור 5 פעמים. השאר על קרח למשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במהירות גבוהה במשך 3 דקות ב microcentrifuge. העברת supernatant לצינור חדש. השאר על קרח עד לשימוש. מחק את הצינור עם פסולת מסיסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדיה מלאה RPMI 1640: להוסיף גלוקוז M 2.5 מ&quot;ל 1, 50 מ&quot;ל חום מומת FBS, ו -5 המניות מ&quot;ל 100x עט סטרפטוקוקוס לתוך 500 מ&quot;ל התקשורת RPMI 1640. השאר על קרח עד לשימוש. </li></ol> בידוד לבלב 3. עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בילודים עם isoflurane, ואחריו עריפת ראש פי הפרוטוקולים שאושרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר עם הבטן שלה פונה כלפי מעלה. תרסיס עם אתנול 70% עבור עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור בבטן עם פינצטה לחתוך את שכבות העור והשרירים longitudinally לאורך קו האמצע עם זוג מספריים, מאזור איברי המין אל כלוב הצלעות. פעולה זו פותחת את חלל הבטן לחשוף את כל האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל האיברים הפנימיים לצלחת 100 ס&quot;מ עם פינצטה. אתר את הלבלב, אשר הוא איבר-מפוזר עם חלק הגבה שדבק הקיבה והטחול וחלק גחון נאחז אל התריסריון 11. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת HBSS לתוך הצלחת כדי להטביע את האיברים. בתמיסה, רקמות הלבלב כבר לא נאחזות תריסריון, קיבה, או הטחול. זה לזיהוי בקלות תחת בהיקף לנתח בגלל צבע לבן האופיינים. השתמש פינצטה לקלף רקמות הלבלב הרחק הרקמה שמסביב ולהעביר לצלחת 60 מ&quot;מ חדש עם HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל הלבלב עם מספריים לחתיכות קטנות יותר מ -5 מ&quot;מ על פני כל מימד. מעבירים צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. עד חמישה pancreata (מתחת לגיל P7) ניתן לעכל בצינור אחד. עבור עכברי P8-P16, להשתמש בצינור אחד לכל לבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 - 1 מ&quot;ל collagenase פתרון עובד על צינור אחד (0.2 מ&quot;ל לכל הלבלב P1-P7 השתמש 0.5 מ&quot;ל לכל הלבלב P8-P16.). השאירו את הצינור 37 ° C חממה עד 15 דקות. להפוך את הצינור שתי פעמים בכל דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ~ 5 דק &#39;, לחץ על צינור לפקח על מצב מערכת העיכול של רקמת לבלב. המשך תהליך העיכול עד שרוב הלבלברקמה מופיעה צבירי תאים מפוצלים כמו, עם קוטר &lt;2 מ&quot;מ. את lysate יופיע מעונן, אשר נובע autolysis תא acinar הנורמלי. </li></ol> 4. כביסה Lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate ב XG 500 עבור 10 שניות ב microcentrifuge. הסר את שכבת supernatant עם pipetman P1,000. את supernatant אמור להופיע עכורים אבל נטול צבירי תאים. אין להשתמש שאיפה, אשר עשוי במהירות לשאוב משם שברי הרקמה בתחתית בשל נוכחותם של כמה DNA דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל RPMI 1640 מדיה מלאה. קש הצינור בעדינות resuspend lysate המקוטעת. היפוך למעלה ולמטה 10 פעמים. חזור על שלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 פעמים נוספות או עד supernatant נראה ברור ומובן. Re- להשעות שברי הלבלב לרחוץ 1 מ&quot;ל להשלים התקשורת RPMI 1640. </li></ol> 5. בידוד איילט הערה: נתונים נמוכים pancreata, בחירה ידנית ישיר להלן (5.1) יכול לשמש איון Isolation. עבור מספר גדול של pancreata (&gt; 6), השיטה המפורטת 5.2 עדיפה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יד חיטוט ישיר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר lysate משלב 4.3 כדי בצלחת 60 מ&quot;מ. הוסף 5 מ&quot;ל להשלים התקשורת RPMI 1640. תביא תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת התאורה בשדה הבהירה על המיקרוסקופ. התאם את עוצמת האור ל ~ 50% של הכוח המרבי. תחת תנאי זה, איים להופיע אשכולות ורודים כמו מעט, בעוד אשכולות סדירים בצורה כהות תאי acinar כמו (איור 1 א). בהגדלה של ~ 50X (שילוב העוצמה של המטרה לבין עֵינִית) מומלץ להציע את הדרך הטובה ביותר של איים חזותי ופתיחת טיפ pipet זמנית לקטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירים איים עם קצה פיפטה P20 תוך הימנעות אשכולות acinar. לוותר איים מועשר שברים לצלחת 60 מ&quot;מ חדש עם התקשורת להשלים RPMI (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הקטיף-יד עוד פעמים. השאר איים טהורים בתוך 60 חדשיםצלחת מ&quot;מ עם 4 מ&quot;ל להשלים RPMI התקשורת (תרשים 1C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה Gradient: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל כי הוא מראש עם 2 מ&quot;ל polysucrose ונתרן diatrizoate בצפיפות של 1.077 גרם / מ&quot;ל. השאירו את הצינור על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה משלב 4.3 על גבי החלק העליון של הפתרון diatrizoate polysucrose ונתרן עם פיפטה פסטר. נא לא להפריע את השכבה התחתונה. רקמות ממרחק של עד 10 שזה עתה נולד או 2 P17 pancreata ניתן לטעון לתוך צינור אחד 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הצינור ב ~ 600 XG ב רוטור נדנדה במשך 15 דקות ב 4 ° C. השתמש בהגדרות בלם פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להעביר את התקשורת ואת שכבות ביניים (לציין כי בתנאי פעולה אידיאליים, האי ימוקם שלבי ביניים בין תקשורת polysucrose והתרבות לאחר צנטריפוגה) לתוך צינור 15 מיליליטר חדש. הוסף 10 מ&quot;ל התקשורת, ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השבר מועשר איוןב XG 300 במשך 5 דקות. הסר את המדיה לשטוף. חזור על לשטוף עוד פעם אחת עם התקשורת RPMI להשלים. כדורי Resuspend ב 4 מ&quot;ל התקשורת, אשר מכיל בעיקר איים ותעלות (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור ידנית איים כמתואר בסעיף 5.1. </li></ol></li></ol> 6. מבחני GSIS ב איים מבודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה איים משלב 5.1.4 התקשורת RPMI להשלים עבור 2 שעות באינקובטור בתרבית רקמה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה להסיר RPMI תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 3 מ&quot;ל פתרון KRB עם 2.8 מ&quot;מ גלוקוז לצלחת 3. מערבולת 10 פעמים כדי לשטוף את האיונים. הסר פתרונות KRB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הכביסה פעם. דגירה איים עם 3 מ&quot;ל פתרון KRB על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באינקובטור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1 מ&quot;ל KRB לבאר כל צלחת 12-היטב. טרום לחמם את מניות צלחת KRB עד 37 ° C באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האיים פעמים עם KRB מחומם מראש כמו 6.2. עָבָרfer 10 איים היטב בכל הלוחות מחומם מראש. מדגירים 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 45 דקות, למשוך 50 μL של supernatant. זו כוללת את פתרון האינסולין המופרש תחת גלוקוז הבזליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 32 גלוקוז μL 500 מ&quot;מ. מערבולת את הצלחת 20 פעמים כדי לערבב את הפתרון. מדגירים 37 ° C חממה. מערבולת הצלחת 5 פעמים אחת ל -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 45 דקות, לסגת supernatant 50 μL. זהו האינסולין המופרש תחת גלוקוז גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל האיונים לצינור מ&quot;ל 1.5. להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להפשיר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חזור על תהליך ההקפאה להפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל 70% אתנול עם 20 מ&quot;מ HCl. ולהשאיר למשך הלילה. זהו האינסולין נותרו איים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קונבנציונאלי ELISA כדי assay רמות אינסולין, שתואר לעיל 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation.">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells.">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li><li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes:+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes.">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li><li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy.">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li><li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans.">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li><li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K++channels.">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li><li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells.">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li><li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3.">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li><li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans.">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li><li>Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. A., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas.">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445 (2015).</li><li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li><li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass.">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests for the described work.

כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול על בידוד איון מ pancreata כי הם קטנים מדי עבור זלוף קונבנציונלי. זה צפוי להניב אי מוכן לכל מחקרים מבוססי האיון כגון טיהור בטא תאים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות בטא תאי איון, התפשטות, תגובות דחק תא, הישרדות תא, מטבוליזם, ותחזוקת GSIS פונקציונלית, וכו. זה יהיה, למיטב ידיעתנו, הפרוטוקול החזותי המפורט הראשון שמנחה חוקרים חדשים לבצע בידוד איון מעכברים בילוד. בלי עוזרים חזותי אלה, ניסוי וטעייה נרחב צפוי עבור רוב החוקרים להשיג בידוד איון מוצלח pancreata קטן. הגורם הקריטי ביותר עבור בידוד איון מוצלח הוא במידה הראויה של עיכול הלבלב כפי שמתואר צעדים 3.6 - 3.8. באופן כללי, הוא תת ושוב-עיכול להפחית תשואת איון. יתר עיכול פשרות נוספות אדריכלות איון, אשר Makes אותם מתאים עבור מבחנים תפקודיים. כדי להשיג תוצאות העיכול הטובות ביותר, התגובה צריכה להיות תחת פיקוח מתמיד כדי להמחיש את תהליך פיצול הרקמות. סומך על משך העיכול לשפוט את ההפרדה איון-acinar היא השיטה שאפשר לסמוך עליו לפחות, כי כל אצווה של collagenase שונה והגיל / גודל של הלבלב מתחיל עמוק משפיע על תהליך העיכול. במקרה של מערכת העיכול תחת, אשכולות אנדוקריני אקסוקרינית גדול ניתן לרחוץ HBSS ולעכל שוב עם collagenase. העיכול אז יכול להיות במעקב ישירות תחת מיקרוסקופ לנתח כדי לקבוע את זמן עיכול המשיך. pipetting עדין יכול גם להיות מנוצל כדי ניתוק רקמות עוזרו. במקרה זה, טיפ P1,000 עם צרכים נפקחות לרווחה להיות מנוצל, אשר מפחית את כוח הגז שעלולה להחריב את הארכיטקטורה איון. יתר מתעכל איים אינם מומלצים ביותר מחקרים מאוחרים יותר, אבל יכולים לשמש מבחנים מסוימים, כגון ניתוח ביטוי גנים עם carefuשולט l. לצד הזהירות לעיל, בשים לב למספר גורמים פרוצדורלי יכול לשפר עוד יותר את התשואה איון הסופי ואיכות. ראשית, Ca 2 + ו Mg 2+ צריך להיכלל כל הפתרונות, אם מקורות לא מסחרי נוצלו. קטיונים אלה נחוצים כדי לשמור על שלמות איון. שנית, פתרון collagenase טרי עם פעילות גבוהה הוא חיוני. פתרון Collagenase עם תוצאות פעילות נמוכה זמן רב יותר עבור דיסוציאציה רקמות. זה גורם autolysis תא אקסוקרינית משמעותי והרס איון. לשם כך, ניצול מניות collagenase עם יותר משלושה סיבובים של פשרת הקפאה אינו מומלץ. צנטריפוגה במהירות שלישית, נמוכה במהלך כביסת רקמות מומלצת. כלל האצבע הוא להשתמש בכוח AG (&lt;500 XG) כי די בכך כדי משקעים אשכולות התא בעת לשמור פסולת התא ב supernatant בשלב 4.1 של הפרוטוקול. מהירות זה לא רק תמנע להרוס אי, אלא גם מסייעת רמהve ופסולת תאיים לאפשר להדמית איון קלה במהלך קטיף יד. לבסוף, collagenase יכול לא להיות מובטל ידי נסיוב 12. לכן, הסרתו על ידי שטיפה חיונית כדי להבטיח שלמות איון מחקרים מאוחרים יותר. לבסוף, יש לציין כי הפרוטוקול המובא צריך להיות מוגבל pancreata העכבר P1 כדי P17. זה לא עובד טוב עבור pancreata מבוגר P18. זלוף קונבנציונלי עבור עכברים מבוגרים אלו מומלצות עבור תשואות טובות יותר איים בריאים. יתר על כן, הרקע הגנטי והגיל של עכברים עמוקים להשפיע על 13,14 תשואת איון. לכן, אפילו בתנאים אופטימליים יניבו מספר שונה של איים לכל לבלב, וזה נורמלי וצפוי.

Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies. 
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Mediatech/Cellgro, Manassas, VA</td><td>MT21020CV</td><td>If HBSS wihout Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; is obtained, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/o glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>polysucrose and sodium diatrizoate solution</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5417C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL centrfuge tubes</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL centrfuge tubes</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&amp;nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&amp;nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm dish</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm dish</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&amp;nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson laboratory, Farmington, CT&amp;nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>The Jackson laboratory, Farmington, CT&amp;nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas

זלוף מבוסס פרוטוקולי איון-במנותק pancreata היונק הגדול מבוססים היטב. פרוטוקולים כאלה נערכים בקלות במעבדות רבות בשל גודלו של צינור הלבלב המאפשר להזרקת collagenase מוכנה זלוף רקמות שלאחר מכן. לעומת זאת, בידוד איון מ pancreata הקטן, כמו זה של עכברים בילוד, הוא מאתגר בגלל זלוף הוא לא בר השגה בקלות את pancreata הקטן. כאן אנו מתארים הליך פשוט מפורט משחזרים מספרים משמעותיים של איים מעכברים שזה עתה נולדו עם סיוע חזותי. pancreata כולו גזור טרי היו מתעכל עם 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase IV מומס תמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס (HBSS) על 37 מעלות צלזיוס, צינורות microcentrifuge. צינורות היו טפח באופן קבוע כדי לסייע בפיזור רקמות. כאשר רוב הרקמה פוזרה לאשכולות קטנים סביב 1 מ&quot;מ, lysates נשטף שלושה עד ארבעה פעמים עם תקשורת ותרבות עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). אשכולות איילט,נטול רקמות acinar לזיהוי, ניתן לשחזר אז תחת לנתח סטריאוסקופ. שיטה זו משחזרת 20 - 80 קטנה עד איים גדולים בגודל לכל לבלב של עכבר שזה עתה נולד. איים אלה מתאימים מבחנים במורד זרם על הדעת ביותר, כולל הפרשת אינסולין, ביטוי גנים, ותרבות. דוגמא assay הפרשת אינסולין מוצגת כדי לאמת את תהליך הבידוד. הרקע הגנטי ומידת העיכול הם הגורמים הגדולים בקביעת התשואה. טרי פתרון collagenase עשה עם פעילות גבוהה הוא מועדף, כפי שהוא מסייע בבידוד אנדוקריני אקסוקרינית. הנוכחות של קטיונים [סידן (Ca 2 +) ומגנזיום (Mg 2+)] בכל פתרונות בסרום שור העובר בכביסה / מדיה לקטוף נחוצים תשואה טובה של איים ביושר ראוי. היקף ניתוחים עם ניגודיות והגדלה טובות יעזור גם.

בתנאים אופטימליים, השיטה המוצגת יכולה להניב 20 - 80 איים מכל לבלב עכבר קטן. מספר זה תלוי ברקע הגנטי, גיל של עכברים, ואת הגודל של איים להיות התאושש. בין נפוץ, CD1 מחוץ התרבו C57BL / 6J טהורי גזע מייצרים פחות איים עם גודל קטן יותר מאשר מכוניות היברידיות בין CD1 ו C57BL / 6 או B6CBAF1 מסחרי / עכברים J לעשות. יד ישירה לקטוף בדרך כלל נתנה מספר קטן יותר של אי, כנראה עקב הדרת האיים קטנים שעלולה להיות קשה מוכרים כאשר מעורבבים עם רקמות אקסוקרינית (איור 1 א-ג). צנטריפוגה Gradient יכול להניב איים נוספים, כולל איים קטנים בתמהיל (1D איור). מבוגרים עכברים גם לייצר יותר איים גדולים, כצפוי מן התפשטות איון נמשך גם לאחר הלידה. מעניין לציין, כי מספר האיון התאושש אינו מתואם ישירות עם גודל לבלב: עכברי CD1 בדרך כלל יש לבלב גדול יותר פרוג F1אניס של CD1 ו C57BL / 6J חצייה. עם זאת עכברים CD1 בדרך כלל מייצרים פחות איים מאשר progenies F1. כך או insufficient- או יתר מערכת העיכול עם תוצאות collagenase בבידוד איון לא טובים. במקרה הראשון, איים גדולים ניתן דמיינו בקלות, ובכל זאת כמה איים לא ניתן להפריד לחלוטין מרקמות acinar (איור 2 א). זה יקטין את התשואה של אי, אבל איים גדולים מיוצרים בדרך כלל. במקרה האחרון, רקמות acinar ניתן ניתק לחלוטין איים. אבל זה פוגע מבנה איון, וכתוצאה מכך איים רבים עם משטחים קשים (איור 2 ב). איי ילודים מבודדים על ידי שיטה זו היו לצפות בפרופילי הפרשת אינסולין. לדוגמה, הן איים P1 ו- P7 מוצג הפרשת אינסולין בזאלי גבוהה (איור 3, השווה את רמות הפרשת אינסולין גלוקוז 2.8 מ&quot;מ between P1-P7 ו איוני p24 בוגרים), פרופילי GSIS טיפוסיים של תאי בטא איון בשלה 7, 9. הדבר מצביע על כך תהליך בידוד האיון שלנו בעיקר משמר את תכונות פעילות של אי בילוד. לפיכך, אנו צופים כי איים אלה הם בכושר סביר ללימודים מבוססים במבחנה אחרות, כוללים ביטוי גנים, חילוף חומרים מנתחים, מבחני הישרדות, ותגובות לחץ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig1.jpg" /> איור 1. מראה של האיים במהלך תהליך הבידוד. (א) pancreata P1 לאחר עיכול collagenase. חץ מצביע על איון יחסי גדול. ראשי חץ להצביע על שני איים קטנים יחסית. (ב) P1 איים אחרי קטיף היד בסיבוב הראשון. (C) איים לאחר handpicking ה -3 rd. (ד) איילט שברים לאחר צנטריפוגה שיפוע. חץ, איון גדול. ראשי חץ,איון קטן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55160/55160fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig2.jpg" /> איור 2. איים לאחר Insufficient- או עיכול מוגזם עם Collagenase. (א) שנבחר בקפידה איים לאחר עיכול תחת, לציין את הקשר בין איים כמה (אשכולות ורודים, חיצים) ותאי acinar (אשכולות כהים, ראשי חץ). (ב) איים לאחר יתר העיכול, לב האיים עם משטחים משוננים (חיצים). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55160/55160fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55160/55160fig3.jpg" /> איור 3. GSIS Results מ האיים מבודדים. נתונים מוצגים הם ממוצעים ± SEM. הם מייצגים את אחוז הפרשת אינסולין (סכום מופרש על הסכום הכולל של האינסולין הכלול איים החל) בתוך חלון assay 45 דקות עם ריכוז סוכר מצוין. איים מעכברי ICR, באמצעות בחירה ידנית ישירה, נוצלו מבחנים אלה. שים לב אי P1 ו- P7 נחשב בשלה, ואילו p24 איים הם 7 בוגרת, 9. ערכי P מחושבים בין קבוצות באמצעות מבחן t. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55160/55160fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas at JoVE.com

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  Vanderbilt University Medical School.  אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון. 

Video: Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioengineering

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Immunology and Infection

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Biology

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video