פרוטוקול זה מספק בקרה מרחבית וזמנית למכלול הננו-חלקיקים הפעילים ב-SERS בהיעדר חומרי צבירה להשגת זיהוי רגיש של אנליזות מטרה. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא שלא משתמשים בחומרי צבירה כדי ליצור את מכלול הננו-חלקיקים הפעילים של SERS ולכן הוא משמש מתאים לניתוח ביומולקולות רגישות בתנאים פיזיולוגיים. זוהי פלטפורמה מבטיחה לאיתור מולקולות אנליטיות כגון סמנים ביולוגיים של מחלות בתמיסות ובתנאים פיזיולוגיים במערכת מיקרופלואידית.
בעת שימוש בשיטה זו בפעם הראשונה, ייתכן שחוקר יצטרך לכוונן את עוצמת הלייזר הלכידה, זמן ההקרנה וריכוז הננו-חלקיקים הכסופים כדי להשיג את הביצועים הטובים ביותר. כדי להתחיל, כוון קרן לייזר בגודל 532 ננומטר ליציאת הפלקס של מיקרוסקופ הפינצטה האופטי. יישר את קרן הלייזר בגודל 532 ננומטר למסלולי הסטריאו הדו-שכבתיים של מיקרוסקופ הפינצטה האופטי באמצעות מראה דיכרואית באורך 750 ננומטר כדי לשלב אותם עם קרני הלייזר המקוריות כדי להתמקד בתא הדגימה.
אסוף את האור המפוזר לאחור מתא הדגימה באמצעות מראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך של 750 ננומטר והפנה אותו לספקטרומטר המכיל מצלמת מכשיר מצומד מטען מקורר בנוזל חנקן. מקם מסנן חריץ של 532 ננומטר לפני חריץ הכניסה של הספקטרומטר לפני הרכישה הספקטרלית. נקו את מגלשת הזכוכית ומכסים את החלקה במים ואתנול.
חבר את סרט המסגרת לשקופית הזכוכית כדי ליצור תא. הוסף כמה טיפות של תמיסת ה-DSNB הננו-חלקיקית הכסופה לתוך המסגרת. הניחו את הכיסוי על סרט המסגרת ואטמו אותו.
הוסף חנקן נוזלי למיכל של מצלמת המכשיר המצומד מטען מקורר בחנקן נוזלי עד שהטמפרטורה תגיע למינוס 120 מעלות צלזיוס. חסום את נתיב קרן הגשושית Raman באמצעות מסך בטיחות לייזר מגנטי, ולאחר מכן הפעל את לייזר מקור העירור Raman בגודל 532 ננומטר. תקן את תא הדגימה עם תמיסת DSNB של ננו-חלקיקי כסף על מחזיק התא.
הוסיפו מים למטרה השקועה במים, ולאחר מכן הניחו את מחזיק התא מיד על המיקרו-במה שמעל המטרה. זרוק שמן טבילה על גבי הכיסוי ומקם את המעבה הטבול בשמן כדי לדמיין חלקיקים במצלמת המיקרוסקופ. התאם את מיקום Z של המטרה על ידי סיבוב ידית המיקרוסקופ עד שקרן הגשושית Raman בגודל 532 ננומטר תתמקד במשטח הזכוכית התחתון של התא, ותראה נקודה לבנה במצלמת המיקרוסקופ.
התאם את מיקומי ה-X וה-Y של המיקרו-סטייג' כדי להזיז את התא כך שימקם את האזור המרכזי של התא בנקודה הלבנה. פתח את תוכנת בקרת הפינצטה האופטית והשתמש בבקרת הג'ויסטיק המצוידת כדי להזיז את לייזר ההשמנה בגודל 1, 064 ננומטר לחפיפה עם הנקודה הלבנה. לאחר מכן, כוונן את ידית המיקרוסקופ כדי להזיז את מיקום Z של המטרה כלפי מעלה.
הפעל את לייזר לכידת 1, 064 ננומטר כדי למשוך ננו-חלקיקי כסף בתא הדגימה וליצור מכלול ננו-חלקיקי כסף פלסמוני. כבו את קרן הלייזר הלכודה כדי למנוע התחממות יתר או היווצרות בועות בעת הצורך. התאם את המיקום של מיקרו-שלב הדגימה כדי למקם את הכתם הכהה של מכלול ננו-חלקיקי הכסף הפלסמוני תחת המיקוד של קרן הגשושית Raman בגודל 532 ננומטר למדידות ספקטרוסקופיות.
מקם את מסנני הצפיפות הנייטרלית מול שקע הלייזר Raman בגודל 532 ננומטר כדי להתאים את ההספק ל-10 מגה-וואט. הזן את זמן הרכישה בלוח ההגדרות בתוכנת הספקטרום ולחץ על כפתור הרכישה כדי להתחיל את הרכישה הספקטרלית. ללא לייזר הלכידה, ננו-חלקיקי הכסף המפוזרים בתא הדגימה יצרו ספקטרום שחור.
הגדלת ההספק והארכת זמן ההקרנה של לייזר הלכידה עלולה למשוך יותר ננו-חלקיקי כסף וליצור כתם כהה. מאחר שננו-חלקיקי הכסף המפוזרים היו תחת תנועה בראונית, הצמתים הבין-חלקיקיים היו גדולים ולא יציבים. העוצמות הכוללות של DSNB בהרכבת ננו-חלקיקי הכסף הפלסמוניים היו גבוהות יותר מאלו של ננו-חלקיק הכסף המפוזר.
בהתחשב בעוצמת השיא האופייני בהופכי של 1, 444 סנטימטרים, מכלול הננו-חלקיקי כסף הפלסמוני יכול לספק שיפור של פי 50 בערך של אות ספקטרוסקופיית הראמן המשופרת על פני השטח של DSNB בהשוואה לזה של חלקיקי הכסף המפוזרים. העוצמות של הפסגות האופייניות של DSNB ב-1, 152, 1, 444 ו-1, 579 ס"מ הופכי על פני 20 ספקטרום ראמאן משופר פני השטח, שורטטו כהיסטוגרמות עם סטיות תקן יחסיות של 6.88, 6.59 ו-5.48% בהתאמה. הדבר החשוב ביותר בהליך זה הוא איתור המיקום של לייזר הגשושית Raman בגודל 532 ננומטר וחפיפה שלו עם לייזר לכידת 1, 064 ננומטר.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לזהות מולקולות אנליטיות עם בקרה מרחבית וטמפורלית בתנאים פיזיולוגיים לניתוח in vivo עתידי.
