שיטה זו מאפשרת לתעד פוטנציאלי פעולה תוך-תאיים זהים ב-MEA'S מסורתיים, ובכך מאפשרת תיאור טוב יותר של צורת ה-AP וסיווג רגיש יותר של פוטנציאלים פרו-קצביים. בהשוואה להקלטות פוטנציאליות שדה טיפוסיות, הצורה הפוטנציאלית התוך-תאית מספקת תובנה רבה יותר לגבי ההרשאה המדויקת של תעלות היונים הבסיסיות. כאשר היא מיושמת על קרדיומיוציטים המופקים מחולים קליניים באמצעות טכנולוגיית תאי גזע, השיטה יכולה לתרום לאבחון סיבתי, והתאמה אישית של C R P ומחלות לב כמו הפרעות קצב הטכנאית שלנו, קארין גבהארדט תדגים את טיפוח הקרדיומיוציטים.
כדי להתחיל לצפות את שדות האלקטרודות של ה-MEA's שהיו בעבר אוטוקלוויים, Dropwise עם פיברונקטין באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. כדי להפחית את הזעזוע האוסמוטי, העבירו את תמיסת הציפוי טיפה למשך 90 שניות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל קרדיומיוציטים מופשרים. הוסיפו בעדינות שמונה מיליליטר של מדיום ציפוי לתוך הצינור וערבבו היטב את השעיית התא.
באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר, הסר את הסופרנטנט, תוך הקפדה שלא להשליך את הכדור ולהתאים את מספר התא לריכוז הסופי. לפני הישיבה בתא הסר את תמיסת הציפוי המיושמת מאזור האלקטרודה MEA באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר. כדי למנוע ייבוש של הציפוי זרעו התאים באופן מיידי על ידי הוספת ארבעה מיקרוליטרים של התאים על שדות האלקטרודה עבור שניהם, שש בארות MEA ובאר אחת M E A.Now, אפשרו לתאים להיצמד לבארות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני.
מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, הוסיפו 200 מיקרוליטרים ומיליליטר אחד של ציפוי סטרילי בינוני מחומם ל-37 מעלות צלזיוס עבור שישה Well MEA, ו-MEA של באר אחת בהתאמה. עבור הקלטות MEA, הנח את מערכת MEA על גבי המכשיר כאשר מחזיק השבב MEA מרוכז מעל החור האובייקטיבי. לאחר מכן אפשר ללייזר להתמקד באלקטרודות על ידי מיקום מערך MEA, כך שהמטרה תהיה ישירות מתחת לחור של מערכת MEA.
כדי לאפשר לתאים להתאושש מההפרעה המכנית, העבירו את שבב ה-MEA עם התאים המעובדים מהאינקובטור למערך ה-MEA 15 דקות לפני ההקלטה. לאחר מכן, נקה את רפידות המגע ואת הפינים בזהירות, באמצעות ספוגית איזופרופנול כדי להפחית את רמות הרעש. הנח את ה- MEA בזהירות במערך MEA, ומקם את שבב MEA שש בארות עם המספר הסידורי הנראה בצד ימין או שבב MEA יחיד היטב עם אלקטרודת הייחוס משמאל.
כעת, הגדר את מערכת MEA לחימום משולב ל -38 מעלות צלזיוס. סגור את המכסה של ההתקן מכיוון שמתג הבטיחות המשולב מאפשר להפעיל את הלייזר רק אם המכסה סגור מעל שבב MEA. באמצעות תוכנית התצורה של MEA הגדר את מסנן מערכת MEA במעבר גבוה ובמעבר נמוך ל-0.1 הרץ או פחות ו-3, 500 הרץ בהתאמה.
השתמש בתוכנת ארון התקשורת MC או בכל תוכנה חלופית להקלטה. התאם את טווח הקלט בהתאם לניסוי. הקפדה על כך שהאות לא ירווה את המגבר ואת קצב הדגימה.
השתמש בפונקציית התצוגה ארוכת הטווח של התוכנה כדי לבדוק את ההקלטה. לאחר הכנסת שבב MEA להגדרת MEA, והגדרת התוכנה אתחל את מכניקת הלייזר באמצעות תוכנת FB ALP. כעת, לחץ על כפתור האתחול.
בסוף האתחול נקודת הלייזר הווירטואלית תהיה בבאר D עבור MEA של שש בארות ובפינה השמאלית התחתונה עבור MEA באר אחת בהתאמה. לאחר מכן באמצעות מקש הבקרה בלחיצת עכבר הזז את נקודת הלייזר הווירטואלית לאמצע האלקטרודה D חמש והתאם את המיקוד על ידי החזקת מקש הבקרה וגלילה עם גלגל העכבר. לחלופין, השתמש בפונקציית המיקוד האוטומטי.
לחץ על הלחצן הגדר P אחד, ונקודת הלייזר הווירטואלית תעבור באופן אוטומטי לתוך הבאר F.המערכת מיושרת כעת. התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן התהליך בהתאם לדרישות הניסוי. כדי להפעיל את הלייזר, לחץ על כפתור כיבוי הלייזר שיופיע כלייזר מופעל, עבור לתוכנת ההקלטה.
בחר שם קובץ ולחץ על כפתור ההקלטה האדום ואחריו כפתור ההפעלה בחלק העליון של החלון כדי להקליט את המדידה. לפני פתיחת התאים עם הלייזר להקליט בסיס במשך 60 שניות. חזור לתוכנת האתחול והשבת אלקטרודות כדי שלא ייכללו בלייזר במפה הווירטואלית בצד ימין של חלון התוכנה.
כדי להתחיל את הלייזר להשתמש Alt לחץ על העכבר, ובחר את האלקטרודה המרכזית של באר זו. זה יוזם את הלייזר לפתוח את התאים על כל אלקטרודה של באר זו באופן אוטומטי, לחזור על כל באר כדי לפתוח את כל האלקטרודות שהופעלו בעבר של באר זו שנבחרה. יש להמיס תחילה את הריכוז המילימולרי של Nifedipine E-40 31, ואת דופטיליד ב-DMSO, ולאחר מכן בריכוז בינוני שלם עד פי 10 מהריכוז הרצוי.
לעולם אל תעלה על ריכוז DMSO סופי של 0.1% בבאר. הקלט את הפעילות הבסיסית למשך 60 שניות. התחל את הלייזר המושרה peration כפי שהודגם קודם לכן, וכתוצאה מכך להפוך את FPS לתוך liAPs.
החל את כל התרופות כריכוז יחיד לכל באר. הסר 20 מיקרוליטרים ו -100 מיקרוליטרים של בינוני לכל באר משש בארות ובאר אחת של MEA בהתאמה. הוסף 20 מיקרוליטר או 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי התרופות שיש למדוד לבאר.
בהתאם לסוג MEA, ובזהירות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים. יש לאפשר לתרכובות להישטף פנימה למשך 300 שניות. במהלך תקופה זו, צורת ה-liAP עשויה להפוך לצורת FP.
שוב, מושרה לייזר המושרה peration ולרשום פגמים אפשריים מורכבים המושרים על liAP במשך 60 שניות נוספות. התוספת של ניפדיפין הפחיתה את שלב הרמה של ה-liAPs באופן תלוי ריכוז, ובכך קיצרה את ה-liAP כולו. קיצור זה היה דומה לפוטנציאל השדה של קרדיומיוציטים מאלקטרודות לא מניפולטיביות.
E-40 31 עיכב את הפולריזציה של KV רלוונטי נקודה אחת 11 תעלות אשלגן והוביל להתנהגות קצבית של קרדיומיוציטים בריכוזים מוגברים. כמו כן, E-40 31 הגדיל את משך ה- liAP באופן תלוי ריכוז. בסוף ה-liAP נצפו סטיות מתח חיוביות קטנות ב-0.1 מיקרומולר שהפכו לבולטות יותר עם ריכוזים גבוהים יותר, מה שמעיד על דה-פולריזציה חדשה וחולפת הנקראת EAD's.
בריכוז הגבוה ביותר של 0.1 מיקרומולאר, EAD אלה הסלימו עם הזמן לפעימות חוץ רחמיות. שהם פוטנציאל פעולה מוקדם מדי. פעימות EAD וחוץ רחמיות הן אינדיקטורים מרכזיים לפעילות פרו-קצבית.
ובסופו של דבר, הפעילות החשמלית גורמת למכות קצביות. קשרי תגובת הריכוז מתואמים עם הקלטות FP ו-liAP. יתר על כן, בנוכחות דופטיליד, הן FP והן liAP הציגו משכי זמן של כשתי שניות בתוך אותה באר, צורת הגל של FP הציגה סטיות רפולריזציה קבועות.
בעוד ב liAP EAD של ניתנים לזיהוי. חשוב להתאים את המיקוד לפני כל מלומן, שכן תמונת מיקרוסקופ מחוץ למיקוד עלולה להשפיע על פתיחת התאים. כמו כן, פוטנציאל הפעולה נלקח זמן קצר לאחר opterperation יש להשתמש לניתוח.
טכניקה זו רגישה יותר באיתור השפעות קצביות קודמות בהשוואה ל- MEA סטנדרטי, ומאפשרת זיהוי מדויק יותר של השפעות מורכבות שליליות.
