אנו מודים לד"ר אוון ג'ליסון וגב' לי ג'ו בליבת ציטומטריית הזרימה ב- UConn Health על עזרתם בציטומטריית זרימה, לד"ר לין פודינגטון במחלקה לאימונולוגיה ב- UConn Health על תמיכתה במכשירים, לגב' סלאווה גאייבסקה ולד"ר פול אפלטון בליבת המחקר הקליני ב- UConn Health על עזרתם בהשגת דגימות דם. אנו מודים לד"ר כריסטופר "קיט" בונין ולד"ר ז'נבה הרגיס מבית הספר לרפואה של UConn על עזרתם בכתיבה מדעית ובעריכה של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01HL145454), המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (P20GM121176), ארה"ב, פרס פיתוח קריירה מאיגוד הלב האמריקאי (18CDA34110426), וקרן סטארט-אפ מ- UConn Health. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

דגימות דם מלא הופרינו התקבלו מתורמים אנושיים בריאים שעברו ביטול זיהוי לאחר קבלת הסכמה מדעת, כפי שאושרה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UConn Health, בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. התקבלה הסכמה מדעת מכל התורמים. קריטריוני ההכללה/אי-הכללה במחקר זה פותחו בקפידה כדי להבטיח את התאמת המשתתפים ולמזער סיכונים פוטנציאליים. המשתתפים הזכאים היו בגילאי 18 עד 65, מכל מוצא אתני, דוברי אנגלית שוטפת ומסוגלים לספק הסכמה מדעת. המשתתפים שהוחרגו כללו את אלה שאינם מסוגלים לספק הסכמה מדעת לעצמם, כגון אלה הזקוקים לנציג מוסמך על פי חוק, אנשים מתחת לגיל 18 או מעל גיל 65, אנשים כלואים ונשים בהריון. בנוסף, המשתתפים היו צריכים להיות חופשיים משימוש בתרופות אנטי דלקתיות וממצבים דלקתיים. זיהומים נוכחיים או מצבים דלקתיים כרוניים או חריפים מתמשכים היו גם קריטריונים לאי-הכללה. לבסוף, אנשים עם היסטוריה נוכחית או אחרונה של הידבקות ב- COVID-19 לא היו זכאים למחקר. קריטריונים אלה נועדו להבטיח את בטיחות המשתתפים והתאמתם תוך מזעור גורמים מבלבלים פוטנציאליים שיכולים להשפיע על תוצאות המחקר.
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>תווך נויטרופילים: הכינו את מדיום הנויטרופילים על ידי הוספת אלבומין בסרום אנושי 2% ל-RPMI-1640 ללא אדום פנול (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>תמיסת fMLP: הכינו את תמיסת fMLP על ידי דילול שלה פי 100 מתמיסת האחסון fMLP dimethyl sulfoxide (DMSO) של 10 mM (ראו טבלת חומרים) עם RPMI 1640 ללא פנול אדום, והתוצאה היא תמיסת fMLP של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>תמיסת נוגדנים: לדלל 120 μL של נוגדן חד-שבטי מצומד אלופיקוציאנין (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ראה טבלת חומרים), המדווח על קונפורמציה בעלת זיקה גבוהה של אינטגרין β2, ב-10 מ"ל של תווך נויטרופילים, ויוצר תמיסת mAb24-APC של 1.2 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>ספרייה מורכבת: לדלל את ספריית התרכובות הראשונית בריכוז של 10 mM עד 1 mM על ידי הוספת 5 μL של ספריית 10 mM (ראה טבלת חומרים) ל 45 μL של DMSO בלוחות 384 בארות באמצעות המטפל בנוזל. לאחר מכן, העבר 5 μL לכל באר של ספריית המתחם 1 mM לצלחת ריקה של 384 בארות באמצעות המטפל בנוזל.</li>
	<li>כפי שמודגם באיור 1, ארבע עמודות (1, 2, 23, 24) הכילו רק DMSO אך לא תרכובות, ושימשו כבקרות חיוביות ושליליות בסינון. לדלל עוד יותר כל באר על ידי הוספת 45 μL של RPMI-1640 ללא פנול אדום, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 100 מיקרומטר עבור כל התרכובות.</li>
</ol>2. בידוד נויטרופילים מדם אנושי
<ol><li>באמצעות פיפטה סרולוגית, שכבה בזהירות של 4 מ"ל דם מעל 8 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (איור 2A).</li>
	<li>צנטריפוגה הדם ב 550 × גרם במשך 30-50 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להאט את הרוטור בהדרגה (גורם האטה של 1). הערה: ההפרדה המוצלחת של נויטרופילים (פס 2 באיור 2B) מתאי דם אדומים עשויה להשתנות בין תורמים. עבור רוב התורמים, צנטריפוגה של 30 דקות מספיקה. אולם עבור תורמים מסוימים, ייתכן שיידרשו 10-30 דקות נוספות של צנטריפוגה אם ההפרדה לא תצליח (איור 2C).</li>
	<li>בזהירות להסיר את הפלזמה (הנוזל הצהוב על גבי) ואת התאים mononuclear (הרצועה העכורה העליונה; רצועת PBMC באיור 2B) באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.</li>
	<li>אספו נויטרופילים מהרצועה העכורה התחתונה (רצועת נויטרופילים באיור 2B) ובערך 3-4 מ"ל מתחת לנוזל השקוף לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). מערבבים בעדינות את תרחיף הנויטרופילים על ידי הפיכתו 2-3 פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה את המתלה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C, ולאחר מכן בזהירות להסיר את supernatant על ידי decanting.</li>
	<li>השהה מחדש בעדינות את הגלולה עם 5 מ"ל של PBS וצנטריפוגה אותו ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant על ידי decanting, ובזהירות לחסל כל שאריות supernatant סביב הפה צינור על דופן הצינור באמצעות שאיבת ואקום. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום נויטרופילים.</li>
	<li>ספור את מספרי התאים באמצעות המוציטומטר. בדרך כלל, 1 עד 4 × 107 נויטרופילים התקבלו מ 8 מ"ל של דם אנושי. הערה: ייתכן שיש זיהום תאי דם אדומים בתרחיף נויטרופילים. תאי דם אדומים אינם משפיעים באופן משמעותי על רוב הבדיקות ויכולים למנוע הפעלת נויטרופילים / פריימינג27. תאי דם אדומים צריכים להיות lysed לפני ספירה כדי לקבל ריכוז נויטרופילים מדויק. הוסף 10 μL של תרחיף התא ל 891 μL של מים deionized עבור 10-30 s כדי lyse את תאי הדם האדומים, ולאחר מכן להוסיף 99 μL של 10× PBS כדי לאזן את הלחץ האוסמוטי, מניעת ליזה של נויטרופילים.</li>
	<li>התאם את צפיפות התא ל- 6.25 × 105 תאים/מ"ל על ידי הוספת תווך נויטרופילים.</li>
</ol>3. הכנת צלחת 384-באר
<ol><li>בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, שלב 1 מ"ל של תמיסת הנוגדנים (1.2 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC) עם 0.2 מ"ל של תווך נויטרופילים כדי ליצור תמיסת 1 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר של התערובת הזו לבארות הבקרה השליליות בצלחת של 384 בארות (הבארות הכחולות באיור 1).</li>
	<li>בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ערבבו 9 מ"ל של תמיסת הנוגדנים עם 21.6 מיקרוליטר של תמיסת fMLP (100 מיקרומטר) ו-1.7784 מ"ל של תווך נויטרופיל כדי ליצור תמיסה המכילה 1 מיקרוגרם/מ"ל mAb24-APC ו-200 ננומטר fMLP. לאחר מכן, הוסיפו 25 μL של תערובת זו לבארות הבקרה והבדיקה החיוביות בלוח של 384 בארות (הבארות האדומות והכחולות באיור 1).</li>
	<li>מעבירים 5 μL מתמיסות התרכובת של 100 מיקרומטר מלוח ספריית התרכובת לצלחת 384 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
	<li>צנטריפוגה את הנוזל למשך דקה אחת ב 500 × גרם, בטמפרטורת החדר. הערה: לצלחות צנטריפוגות נדרשים רוטור דלי נדנדה ודלי צלחות.</li>
</ol>4. טיפול בתאים
<ol><li>הוסף 20 μL של תרחיף נויטרופילים לכל באר באמצעות פיפטה 16 ערוצים (טווח 5-50 μL, עבור כל עמודה של צלחת 384 באר). מערבבים בעדינות 5-10 פעמים באמצעות הפיפטה, תוך שמירה על מרווח זמן קבוע בין כל פיפטה. הערה: הריכוזים הסופיים בבארות הם כדלקמן: נויטרופילים 2.5 × 105 תאים/מ"ל (כל הבארות); mAb24-APC 0.5 מיקרוגרם/מ"ל (כל הבארות); fMLP 100 ננומטר (בארות בקרה ובדיקה חיוביות); תרכובות 10 מיקרומטר (בארות בדיקה).</li>
	<li>דוגרים על הצלחת על שייקר ב-300 סל"ד, בטמפרטורת החדר (RT), למשך 10 דקות.</li>
	<li>תקן את התאים על ידי הוספת 3 μL של 16% paraformaldehyde (PFA) לכל באר באמצעות פיפטה 16 ערוצים (ריכוז PFA סופי ~ 0.91%). לאחר מכן, לדגור על קרח במשך 10 דקות. הערה: מומלץ לשמור על מרווח זמן עקבי בין עמודות שונות בעת הוספת נויטרופילים ו- PFA. זה מבטיח שלנויטרופילים בכל באר יהיה אותו זמן דגירה עם fMLP ו-mAb24-APC.</li>
</ol>5. ציטומטריית זרימה
<ol><li>הפעל את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים) וודא שגם המחשב המחובר למכשיר מופעל.</li>
	<li>ודא שמיכל נוזל הנדן מלא, ומיכל הפסולת ריק ומחובר כראוי למכשיר.</li>
	<li>טען את צלחת 384 הקידוח על מעמיס הדגימה של ציטומטר הזרימה. ודא שבאר A1 של הצלחת מיושרת עם סימן A1 על המעמיס.</li>
	<li>פתח את התוכנה וצור ניסוי חדש. בחר 384 היטב ובחר את fluorophores הרצוי. לאחר מכן, לחץ על הגדרת לוחית, גרור כדי לבחור את כל הבארות ולאחר מכן לחץ על מדגם. הפעל את המתג "תפוקה גבוהה" ובחר גבוה בחלונית התעריפים.<ol><li>בתיבת עוצמת הקול, הזן 50. בחר דוגמאות בעמודות אי-זוגיות ולאחר מכן הפעל את המתג "תסיסה". לבסוף, תן שם לדוגמאות בחלונית הימנית.</li>
	</ol></li>
	<li>לחץ על מגרש ושער. לאחר מכן, לחץ על כפתור החל (שני חצים על עיגול מלא ירוק), ולאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה (צורת משולש). המתן מספר שניות כדי לצפות בכמה תאים מהבאר הראשונה ולאחר מכן לחץ על כפתור ההשהיה .<ol><li>התאם את מתחי FSC ו- SSC כדי להבטיח הדמיה נכונה של תאים במגרש. לחץ על רכישה ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה (צורת משולש) כדי להתחיל את הבדיקה.</li>
	</ol></li>
	<li>ציטומטר הזרימה ידגום ברצף ~ 50 μL של 1000-3000 נויטרופילים מכל באר. זה ייקח בערך 3 שעות כדי להשלים את כל צלחת 384-באר.</li>
	<li>לאחר השלמת כל הדגימות, יצא את קבצי ה- .fcs לשלב הבא.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח את התוכנה לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה (ראה טבלת חומרים). בחר וגרור את התיקיה המכילה את כל קבצי ה- .fcs לחלון התוכנה ולאחר מכן שחרר כדי לייבא את הנתונים לתוכנה.</li>
	<li>לחץ פעמיים על דגימה אחת, שער נויטרופילים בודדים המבוססים על FSC ו- SSC28,29,30 בחלון המוקפץ, כפי שמוצג באיור 3. בחר את השורות המגודרות וגרור אותן לתיקיה ולאחר מכן שחרר כדי להחיל את ה- gating על כל הדגימות בתיקיה זו.</li>
	<li>חשב וייצא את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של APC (MFI) של נויטרופילים מכל באר באמצעות פונקציית עורך הטבלאות של התוכנה. לחץ על הוסף עמודה תחת הכרטיסייה עריכה . בחר חציון בכרטיסייה סטטיסטיקה , בחר את הנויטרופילים של האוכלוסייה המגודרת ובחר APC כפרמטר. לחץ על בסדר לחצן.</li>
	<li>חזור לכרטיסייה "עורך טבלה", בחר כל הדגימות בכרטיסייה "קבוצה" ולחץ על הלחצן צור טבלה . יופיע חלון חדש המציג את הטבלה שנוצרה. שמור אותו כקובץ טקסט, CSV או Excel.</li>
	<li>פתח את הטבלה המיוצאת, חשב את הערך הממוצע וסטיית התקן של APC MFI עבור דגימות הבקרה החיוביות והשליליות (איור 4).</li>
	<li>חשב את גורם Z (Z') של הלוח באמצעות המשוואה: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), כאשר σ p ו- σ n הן סטיות התקן של הפקדים החיוביים והשליליים, בהתאמה, ו- μp ו- μn הם אמצעי הבקרה החיובית והשלילית, בהתאמה31. הערה: גורם Z מציין את ההפרדה בין התפלגות הבקרה החיובית והשלילית. Z' של 0 פירושו שאין הפרדה, ואילו Z' של 0.5 מציין הפרדה שווה. כפי שהוזכר במחקר קודם31, Z' > 0.5 מצביע על בדיקה מצוינת לסינון מורכב. Z' בטווח של 0.5 עד 0 מקובל, אך הוא עשוי לזהות רק פגיעות חזקות בבדיקה, מה שידרוש אימות נוסף בבדיקות משניות.</li>
	<li>חשבו על תרכובות כ"מכה" לסינון כאשר APC MFI של נויטרופילים שטופלו בתרכובות נמוך מפי שלושה מסטיית התקן של MFI הבקרה החיובית שהופחתה מ-MFI הבקרה החיובית (P = 0.0013, המיוצג על-ידי הקו המקווקו באיור 4).</li>
</ol>

סינון של מעכבי הפעלת אינטגרין β2 בנויטרופילים אנושיים

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

ההתחלה והסיום של גירוי נויטרופילים וצביעה נקבעים על ידי תוספת של נויטרופילים ו- PFA קיבוע. לכן, הבטחת מרווח זמן זהה בין צנרת נויטרופילים או PFA לתוך כל עמודה היא קריטית. זה מבטיח שהגירוי וזמן הצביעה של נויטרופילים מכל באר יישאר עקבי. בשל תוחלת החיים הקצרה של נויטרופילים, הניסוי כולו, החל מאיסו?...

מחלות דלקתיות רבות מאופיינות בחדירת נויטרופילים באתר של נפיחות או פציעה1. כדי לחדור לרקמות אלה, נויטרופילים חייבים להשלים את מפל גיוס הנויטרופילים, הכולל מעצר לאנדותל, אקסטרווזיה על פני דופן כלי הדם, וגיוס לרקמה2. נויטרופילים במחזור הדם זקוקים להפעלת אינטגרין β2 כדי להשלים מפל זה, במיוחד עבור שלב המעצר. לפיכך, תרופות מעכבות אינטגרין המפחיתות הידבקות נויטרופילים, אקסטרווציה וגיוס עשויות לטפל ביעילות במחלות דלקתיות 3,4.
אינטגרינים β2 היו יעד למחלות דלקתיות בעבר. Efalizumab, נוגדן חד שבטי המכוון ישירות לאינטגרין αLβ2, פותח לטיפול בפסוריאזיס5. עם זאת, efalizumab נסוג בשל תופעת הלוואי הקטלנית שלה - leukoencephalopathy multifocal מתקדם כתוצאה הפעלה מחדש של וירוס JC 6,7. טיפולים חדשים מבוססי אינטגרין אנטי דלקתיים צריכים לשקול שמירה על הפונקציות נוגדות הזיהום של לויקוציטים כדי למזער את תופעות הלוואי. תופעות הלוואי של efalizumab עשויות לנבוע ממחזור ממושך של נוגדנים חד שבטיים בזרם הדם, אשר עלול לעכב את תפקוד החיסון בטווח הארוך8. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי efalizumab מתווך αLβ2 crosslinking ואת הפנמה לא רצויה של אינטגרינים α4, מתן הסבר חלופי לתופעות הלוואי9. לכן, אנטגוניסטים קצרי מועד, מולקולות קטנות, עשויים להימנע מבעיה זו.
שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון אנטגוניסטים אינטגרין של מולקולות קטנות β2 באמצעות נויטרופילים אנושיים מוצגת כאן. הפעלת אינטגרין β2 דורשת שינויים קונפורמטיביים של אקטודומיין האינטגרין כדי לקבל גישה ולהגדיל את זיקתו לליגנד שלו. במודל Switchblade הקנוני, אקטודומיין האינטגרין הסגור המכופף מתרחב תחילה לקונפורמציה מורחבת-סגורה ולאחר מכן פותח את כיסוי ראשו לקונפורמציה מורחבת-פתוחה המופעלת במלואה10,11,12,13. יש גם מסלול חלופי שמתחיל מהכפוף-סגור לכפוף-פתוח ומורחב-פתוח, בסופו של דבר 14,15,16,17,18,19. הנוגדן הספציפי לקונפורמציה mAb24 נקשר לאפיטופ בתחום דמוי β2-I האנושי כאשר כיסוי הראש של האקטודומיין פתוח20,21,22,23.
כאן, mAb24-APC משמש כדי לקבוע אם אינטגרינים β2 מופעלים. כדי להפעיל נויטרופילים ואינטגרין, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), פפטיד כימוטקטי קצר שמקורו בחיידקים שיכול להפעיל נויטרופילים β2 integrins24, משמש כגירוי בפרוטוקול זה. כאשר fMLP נקשר ל-Fpr1 על נויטרופילים, מופעלים מפלים איתות במורד הזרם המערבים חלבוני G, פוספוליפאז Cβ ופוספואינוסיטיד 3-קינאז γ. אירועי איתות אלה גורמים בסופו של דבר להפעלת אינטגרין דרך מסלול האיתות מבפנים החוצה18,25. מלבד אנטגוניסטים של מולקולות קטנות שנקשרים ישירות לאינטגרינים β2 ומונעים שינויים קונפורמטיביים של הפעלת אינטגרין26, תרכובות שיכולות לעכב רכיבים במסלול איתות ההפעלה של אינטגרין β2 מבפנים החוצה יזוהו גם בשיטה זו. ציטומטרים אוטומטיים של זרימה מאפשרים סינון בתפוקה גבוהה. זיהוי אנטגוניסטים חדשים עשוי לא רק להעמיק את הבנתנו בפיזיולוגיה של אינטגרין, אלא גם לספק תובנה תרגומית לטיפול אנטי-דלקתי מבוסס אינטגרין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

פרוטוקול זה נועד לבסס שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2, תוך שימוש בנוגדנים המדווחים על שינויים קונפורמטיביים וציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה. השיטה יכולה לשמש גם כמדריך לשיטות סינון אחרות מבוססות נוגדנים בתפוקה גבוהה. אינטגרינים β2 הם מולקולות הידבקות ספציפיות לויקוציטים החיוניות לתגובות חיסוניות. נויטרופילים מסתמכים על הפעלת אינטגרין כדי לצאת מזרם הדם, לא רק כדי להילחם בזיהומים אלא גם כדי להיות מעורבים במחלות דלקתיות מרובות. שליטה בהפעלת אינטגרין β2 מציגה גישה בת קיימא לטיפול במחלות דלקתיות הקשורות לנויטרופילים. בפרוטוקול זה, נוגדן חד-שבטי, mAb24, אשר נקשר באופן ספציפי לכיסוי הראש בעל הזיקה הגבוהה של אינטגרינים β2, משמש לכימות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים ראשוניים מבודדים. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) משמש כגירוי להפעלת אינטגרינים β2 נויטרופילים. במחקר זה נעשה שימוש בציטומטר זרימה בתפוקה גבוהה המסוגל להריץ באופן אוטומטי דגימות לוחות של 384 בארות. ההשפעות של 320 כימיקלים על עיכוב אינטגרין β2 מוערכות תוך 3 שעות. באמצעות גישה זו ניתן לזהות מולקולות התוקפות ישירות לאינטגרינים β2 או מולקולות מטרה במסלול איתות ההפעלה מבפנים החוצה המופעל על ידי קולטן G המצומד לחלבון.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

מחבר זרקור: פיתוח שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2 

טכניקת תפוקה גבוהה מבוססת ציטומטריה של זרימה לבדיקת תרופות מעכבות אינטגרין

Our research is focused on neutrophil integrin, and in this study we aim to establish a method to find small molecular antagonists of Beta-2 integrin activation. We believe with this method we can find new antagonists that may deepen our understanding in integrin physiology, and also provide translational insight into integrin-based anti-inflammatory therapy. In the future, we will focus on discovering new anti-inflammatory drugs and dissecting their mechanisms of action.

נתונים מבדיקת לוחות 384 בארות מייצגת (איור 4) גילו כי לבקרות שליליות היה MFI של mAb24-APC של 3236 ± 110, בעוד שלבקרות חיוביות היה MFI של mAb24-APC של 7588 ± 858. מקדם Z' עבור צלחת זו הוא בערך 0.33, שהוא בטווח מקובל31. עם זאת, Z' דורש אימות נוסף במבחני משנה.
כדי לנרמל את הנתונים,...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of β2 Integrin Activation at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטת סינון מבוססת ציטומטריה של זרימה בתפוקה גבוהה לזיהוי תרופות במולקולות קטנות המעכבות הפעלת אינטגרין β2 על נויטרופילים אנושיים.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

המחקר שלנו מתמקד באינטגרין נויטרופילים, ובמחקר זה אנו שואפים לבסס שיטה למציאת אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין בטא-2. אנו מאמינים שבאמצעות שיטה זו נוכל למצוא אנטגוניסטים חדשים שעשויים להעמיק את ההבנה שלנו בפיזיולוגיה של אינטגרין, וגם לספק תובנה תרגומית לטיפול אנטי דלקתי מבוסס אינטגרין. בעתיד נתמקד בגילוי תרופות אנטי דלקתיות חדשות ובניתוח מנגנוני הפעולה שלהן.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K Views.  UConn Health. המחקר שלנו מתמקד באינטגרין נויטרופילים, ובמחקר זה אנו שואפים לבסס שיטה למציאת אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין בטא-2. אנו מאמינים שבאמצעות שיטה זו נוכל למצוא אנטגוניסטים חדשים שעשויים להעמיק את ההבנה שלנו בפיזיולוגיה של אינטגרין, וגם לספק תובנה תרגומית לטיפ...

Video: מחבר זרקור: פיתוח שיטה לזיהוי אנטגוניסטים מולקולריים קטנים של הפעלת אינטגרין β2 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.