חשיבותו של הפרוטוקול נעוצה בנוחיותו בזמן הקצר הדרוש להשלמתו. זה מאפשר תפוקה גבוהה, ריכוז גבוה, ורמה גבוהה של בידוד של טריכומות גבעול ו sessile. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הישירות שלה.
במהלך טכניקה זו, יש לקחת בחשבון את צפיפות הטריכומה של מקור הצמח ולבדוק את מידת הבידוד בכל שלב באמצעות מיקרוסקופ תוך ביצוע הפרוטוקול בפעם הראשונה. מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה נורית שלו, מומחית לקנאביס ממכון וולקני. התחילו בריסוק גוש קרח יבש לפתיתים קטנים ועדינים בעזרת פטיש וחפץ קשה ושטוח במיכל פלסטיק של חמישה ליטר.
השתמשו במסננת גדולה, וסננו את פתיתי הקרח היבש הדק מהקרח היבש הלא כתוש למיכל פלסטיק נוסף של חמישה ליטר. יוצקים כ-200 סנטימטרים מעוקבים של פתיתי הקרח היבשים לתוך זכוכית זקופה של ליטר אחד. מוסיפים עד 10 גרם של תפרחות קנאביס סאטיבה קפואות על השכבה הראשונה של קרח יבש כתוש, ומכסים אותה בשכבה נוספת של 200 סנטימטרים מעוקבים של קרח יבש כתוש דק.
לאחר מכן כסו את פתח הזכוכית בליטר אחד בשתיים עד שלוש שכבות של כילה נגד יתושים בעל מסך של מילימטר אחד, ואבטחו אותה בגומיות. לאחר מכן, יוצקים חנקן נוזלי לתוך מיכל נירוסטה גדול עגול תחתית. הכניסו רשת של 350 מיקרומטר למסננת קמח או מסננת כדי לכסות את רשת ניפוי הקמח מלמטה.
הניחו את מסננת הקמח מעל מיכל הנירוסטה הגדול בעל התחתית העגולה המלאה בחנקן נוזלי. כדי למזער את אובדן המסה המנופה, יש לוודא שרוחב המיכל עולה על זה של מסננת הקמח. הפרידו את הטריכומות מהחומר הצמחי על ידי ניעור ליטר אחד כאשר הפתח שלה מצביע כלפי מטה לכיוון מסננת הקמח.
מניחים בצד את הכד כל שתיים-שלוש דקות, ומאפשרים ניפוי של הקרח היבש כתוש והחומר הצמחי שהצטבר על מסננת הקמח. מנפים את מסננת הקמח בצורה אופקית כדי להקל על מעבר החומר הצמחי לחנקן הנוזלי במיכל הנירוסטה בתחתית העגולה הממוקם מתחת. לאחר מכן, הוסף חנקן נוזלי למיכל הנירוסטה ואת הקרח היבש כתוש לכוס זכוכית של ליטר אחד כאשר רמתם נמוכה.
כאשר החומר הצמחי על מסננת הקמח מתרוקן, ממלאים מחדש את החומר הצמחי המשומש בכוס הזכוכית ב-10 גרם נוספים של חומר צמחי טרי, וחוזרים על תהליך הניפוי עד לאיסוף כמות מספקת של טריכומות מועשרות במיכל. ודא את נוכחותו של חומר דמוי אבקה לבנה בתחתית מיכל הנירוסטה השקוע בחנקן נוזלי לפני תצפית במיקרוסקופ כדי לאשר את איסוף הטריכומות המספיקות. הוסיפו כמות קטנה של חנקן נוזלי למיכל נירוסטה נקי ועגול בעל תחתית עגולה.
לאחר מכן קפלו פעמיים מיקרו-מסננת בגודל 40 על 40 ס"מ בגודל רשת של 150 מיקרומטר כדי לקבל קיפול של 20 על 20 סנטימטרים, ופתחו אותה בצורה דמוית חרוט. הצמידו את חרוט הרשת לקצה מיכל הנירוסטה בעל התחתית העגולה בעזרת סיכת כביסה אחת או שתיים, כך שהחלק הפתוח של החרוט יהיה זקוף, וחלקו המחודד יהיה שקוע בחלקו בחנקן נוזלי. לאחר שתסיים, שפכו בעדינות את החנקן הנוזלי המכיל את החומר דמוי האבקה הלבנה שהתקבל קודם לכן לתוך חרוט המיקרו-מסננת.
בעזרת מברשת רחבה, אספו והעבירו כל חומר צמחי שנותר מהמיכל הראשון לתוך חרוט הרשת בגודל 150 מיקרומטר. לאחר מכן, נתקו בזהירות את סיכת הכביסה ממכסה המיכל, ופתחו את חרוט המיקרו-מסננת כדי לאתר את הטריכומות באמצע המסננת הפתוחה. החזיקו את כל ארבע פינות המסננת יחד, והטביעו את החלק האמצעי המכיל את הטריכומות בחנקן נוזלי.
טבלו בעדינות ונערו את המסננת בחנקן הנוזלי למשך דקה אחת. באמצעות מחט סטרילית, לעשות חורים זעירים במכסה של מבחנה 50 מיליליטר כדי למנוע בניית לחץ. גרפו את פסולת הצמחים הלא מנופה, הקרח היבש והטריכומות הגדולות יותר העטופות במרכז המסננת לתוך מבחנה של 50 מיליליטר, ואחסנו אותה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
להעביר את הטריכומות מנופות שקוע בחנקן נוזלי ברצף דרך microsieves, לאחר להקטין את גודל לשפוך מ 105 ל 80 ל 65, ולאחר מכן ל 50 מיקרומטר. לאחר כל העברה, אספו בנפרד את הטריכומות בגדלים שונים שנותרו על המסננת ותייגו אותן. עשו חורים זעירים במכסה הצינור באמצעות מחט סטרילית.
מעבירים את הטריכומות הרצויות הטבולות בחנקן נוזלי ועטופות במיקרו-מסננת בגודל 50 מיקרומטר לצלחת נקייה בעזרת כף מצוננת מראש. לאחר מכן העבירו במהירות את הטריכומות דמויות האבקה לצינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש באמצעות מרית מקוררת מראש, ואחסנו מיד את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס למחקרים נוספים. בשלב הראשוני של תהליך הבידוד, חתיכות של רקמת עלה היו דומיננטיות בחלק המבודד, בניגוד לתוצר הבידוד הסופי, שהורכב כולו מטריכומות מבודדות לא מזוהמות.
האיכות של גבעול הקפיטט הגרגירי המבודד והטריכומות הססיליות נצפתה בשלב הבידוד הסופי. טוהר הטריכומות שבודדו בשיטה זו היה דומה לפרוטוקול קונבנציונלי. מבנה ראש הטריכומה הגבעול העדין נשמר, וכל ראשי הטריכומה המבודדת נראו, בניגוד לשיטה המסורתית, שבה חסר מבנה ראש הטריכומה השלם, והיו בו רק תאי דיסק.
מיצוי ה-RNA והערכת שלמות ה-RNA של הטריכומות המבודדות הצביעו על מספר גבוה של שלמות RNA או ערכי RIN מ-9.4 עד 10, וכרומטוגרפיית הג'ל הצביעה על שלמות RNA גבוהה. בצע בזהירות את תנועת העירוי דמוית שקית T של בידוד מיקרו 150 עד 50 מיקרו. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ההרכב הטרנסקריפטומי וכנראה הפרוטאומי של טריכומות מקנאביס וטריכומות של מיני צמחים אחרים.
לאחר הליך זה ניתן לבצע אפיונים מטבוליים ותעתיקים. שיטות נוספות אלה יכולות לסייע בהבנת רמות הביטוי של הגנים בטריכומות המבודדות והפרופילים המטבוליים שלהם. טכניקה זו אפשרה אפיון שעתוק של טריכומות בלוטות מזני קנאביס שונים.
