הפרוטוקול שלנו מספק כלים לחקר אפיתל מעי החזיר למחקר וטרינרי וביו-רפואי. אורגנואידים במעיים מחזירים יכולים לשמש לחקר הובלת חומרי מזון, תפקוד מחסום ואינטראקציות בין מיקרואורגניזמים מארחים. באמצעות שימור של קריפטים אפיתל מעיים חזיר מאפשרים ליצור מלאי גדול של תאי גזע כי מאוחר יותר ניתן להשתמש בהם לתרבית אורגנואיד ב monolayers 3D או 2D.
פרוטוקול זה מפורט עבור הג'ג'ונום, אך ניתן להשתמש בו גם עבור מקטעי מעיים אחרים כגון תריסריון, איליאום ומעי גס. כדי להתחיל, במהירות להפשיר בקבוקון המכיל 900 crypts קפואים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. העבר את תמיסת הקריפטה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant. הוסף 150 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית או ECM עם קצה מקורר כדי לקבל ריכוז סופי של 150 crypts לכל 25 מיקרוליטר של ECM. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להשיג השעיה הומוגנית של crypts ב ECM.
זרעו שש בארות עם טיפה של 25 מיקרוליטר לבאר בצלחת 48 בארות שחוממה מראש. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% לצורך פילמור של ה-ECM. מוסיפים 250 מיקרוליטר לבאר של תרבית בינונית בטמפרטורת החדר ודגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
החליפו את מדיום התרבות כל יומיים-שלושה. כדי להעביר אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם בקריפטות קפואות 10 ימים לאחר הזריעה, הסירו את מצע התרבית והוסיפו 250 מיקרוליטר PBS שחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, החלף את PBS עם 250 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה אנזים מחומם מראש בתוספת 10 מעכב סלע מיקרומולרי ב 37 מעלות צלזיוס בכל באר.
נתק את האורגנואידים ב- ECM על ידי גירוד עם פיפטה P-1000 והומוגניזציה בזהירות על ידי פיפט חמש פעמים. יש לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני לפני ניתוק התאים על ידי פיטינג למעלה ולמטה 10 פעמים. הוסף 500 מיקרוליטר של DMEMc בכל באר המכילה תאים מנותקים ומשוך עד 12 בארות בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של DMEMc קר.
צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-DMEMc קר במיליליטר אחד. ספרו את התאים עם דילול של אחד עד שניים בכחול טריפאן עם מונה תאים.
צנטריפוגה את הנפח הדרוש של תמיסת התא כדי לקבל 3000 תאים חיים לכל כיפה. להשעות את הגלולה עם 17 מיקרוליטר של DMEMc קר לכל 3000 תאים חיים על קרח. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש.
הוסף לאט 33 מיקרוליטר של ECM קר לכל 3000 תאים חיים. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש והומוגניזציה מבלי ליצור בועות. לאחר מכן לראות את הבארות עם 50 מיקרוליטר של השעיית תא ECM לכל באר בצלחת 24 בארות שחוממה מראש לדגור במשך 30 דקות פילמור של ECM.
מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום התרבית לכל באר. לאחר מכן דוגרים ומשנים את מדיום התרבית כל יומיים-שלושה. כדי לצפות את תוספת התרבית, הכינו את תמיסת הציפוי המכילה קולגן IV מדולל ב-50 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS קר.
מוסיפים 150 מיקרוליטר של תמיסת הציפוי המדולל לכל תרבית תאים, מחדירים ודגרים למשך לילה או שלוש שעות. חמישה ימים לאחר הפיצול, נתקו את האורגנואידים עם ה-ECM על ידי גירודם עם פיפטה P-1000. הומוגני בזהירות על ידי פיפטינג בתווך התרבית ולהעביר לצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של DMEMc קר על קרח.
צנטריפוגה את האורגנואידים שנאספו ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה אנזים שחומם מראש בתוספת מעכב ROCK מיקרומולרי 10. פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים כדי ליזום דיסוציאציה של האורגנואידים.
לדגור במשך חמש דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לעיכול אנזימטי. לשבש מכנית את האורגנואידים על ידי pipetting 10 פעמים ולהוסיף ארבעה מיליליטר של DMEMc קר כקרח. צנטריפוגה ולהשליך את supernatant לפני resuspending את גלולת התא organoid במיליליטר אחד של DMEMc.
ספרו את התאים בכחול טריפאן עם מונה תאים וחשבו את הנפח הדרוש לזרע 2.5 כפול 10 עד התאים החמישיים לכל תוספת תרבית. צנטריפוגה את הנפח הדרוש של תרחיף התא המתאים 2.5 פעמים 10 של התאים החמישי לכל תוספת תרבית. במהלך הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את תמיסת הציפוי מתוספות התרבית ואפשרו לה להתייבש מתחת למכסה המנוע ללא המכסה במשך חמש דקות.
לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בנפח הדרוש של מדיום דו-ממדי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולארי. זרעו 200 מיקרוליטר של תרחיף התא על הקרום החדיר המצופה. הוסף 500 מיקרוליטר של המדיום הדו-ממדי בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי לתא התחתון ודגירה.
צפיפות גבוהה של תאים יש לראות על הממברנה. יום לאחר הזריעה, החלף את המדיה האפית והבסיסית במדיה דו-ממדית רעננה ללא מעכב ROCK. שנה את המדיה בכל יום.
החד-שכבה מתמזגת יום אחד לאחר הזריעה וניתן להשתמש בה לניסוייה. במחקר זה, קריפטות אפיתל התקבלו ממעי החזיר ונשמרו בהקפאה לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי. לאחר ההפשרה, תאי הגזע של הקריפטה נזרעו ב- ECM.
האורגנואידים נצפו תוך שלושה עד ארבעה ימים וגדלו במהירות ופיתחו מבנים ניצנים. כ-10 ימים לאחר ההפשרה, בוצע מעבר של אורגנואידים כדי להרחיב את התרבות. לתחזוקה אופטימלית של התרבית, האורגנואידים המשמשים לאריזה חייבים להציג לומן ברור וריק וקצוות מוגדרים היטב ללא פסולת שחורה בלומן כפי שנצפה באורגנואידים בוגרים.
תאים מתחברים ויוצרים חד-שכבה מתמזגת לחלוטין תוך יום אחד, אשר מאושרת על ידי התנגדות חשמלית טרנסאפיתל גבוהה, או TEER, של כ -700 סנטימטרים רבועים. ה-TEER נשאר גבוה במשך שלושה ימים. צביעת אקטין מצביעה על כך שהצד האפי של תאי האפיתל מכוון לכיוון הלומן באורגנואידים תלת-ממדיים.
תאים אורגנואידים שנזרעו בתוספות תרבית יוצרים שכבה אחת של תאי אפיתל כאשר הצד האפי מכוון לכיוון התא העליון. צביעת אוקלודין חושפת את נוכחותם של צמתים הדוקים בצד האפי של תאי האפיתל באורגנואידים תלת-ממדיים ובחד-שכבות של תאים. חשוב לזכור כי אורגנואיד המשמש לזרע חד-שכבות תאים צריך להיראות צלול עם לומן ריק ללא פסולת שחורה המתאימה להצטברות של תאים מתים.
ניתן להשתמש בחד-שכבות מאורגנואיד מעי חזיר כדי לבדוק את ההשפעות של מטבוליטים או מיקרובים על תפקוד מחסום האפיתל באמצעות בדיקות פונקציונליות, הדמיה וניתוח ביטוי גנים.
