Protokolümüz, veterinerlik ve biyomedikal araştırmalar için domuz bağırsak epitelini incelemek için araçlar sağlar. Domuzlardan elde edilen bağırsak organoidleri, besin taşınmasını, bariyer fonksiyonunu ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Domuz bağırsağının korunması sayesinde, epitel kriptleri, daha sonra 3D veya 2D monokatmanlarda organoidi kültürlemek için kullanılabilecek büyük bir kök hücre stoğu oluşturmaya izin verir.
Bu protokol jejunum için detaylandırılmıştır, ancak duodenum, ileum ve kolon gibi diğer bağırsak segmentleri için de kullanılabilir. Başlamak için, 37 santigrat derecedeki bir su banyosunda 900 dondurulmuş kript içeren bir şişeyi hızla çözün. Kript çözeltisini 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. 25 mikrolitre ECM başına 150 kript nihai konsantrasyonu elde etmek için soğutulmuş bir uçla 150 mikrolitre hücre dışı matris veya ECM ekleyin. ECM'de homojen bir kript süspansiyonu elde etmek için 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
Önceden ısıtılmış 48 delikli bir plakada kuyu başına 25 mikrolitrelik bir damla ile altı kuyucuğu tohumlayın. ECM'nin polimerizasyonu için 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında ortam kültürü kuyusu başına 250 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Kültür ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Dondurulmuş kriptlerden elde edilen 3D organoidleri tohumlamadan 10 gün sonra geçmek için, kültür ortamını çıkarın ve 37 santigrat derecede 250 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ekleyin. İnkübasyondan sonra, PBS'yi, her bir kuyucukta 37 santigrat derecede 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş 250 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim ayrışma reaktifi ile değiştirin.
ECM'deki organoidleri bir P-1000 pipetle kazıyarak ayırın ve beş kez pipetleyerek dikkatlice homojenize edin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırmadan önce 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte beş dakika boyunca inkübe edin. Ayrışmış hücreler içeren her bir kuyucuğa 500 mikrolitre DMEMc ekleyin ve üç mililitre soğuk DMEMc içeren 15 mililitrelik bir konik tüpte 12 kuyucuğa kadar çekin.
Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti bir mililitre soğuk DMEMc'de yeniden askıya alın. Bir hücre sayacı ile tripan mavisinde bir ila iki seyreltme ile hücreleri sayın.
Kubbe başına 3000 canlı hücreye sahip olmak için hücre çözeltisinin gerekli hacmini santrifüjleyin. Pelet, buz üzerindeki 3000 canlı hücre başına 17 mikrolitre soğuk DMEMc ile tekrar askıya alın. Ses seviyesini gerekli kuyu sayısına ayarlayın.
3000 canlı hücre başına yavaşça 33 mikrolitre soğuk ECM ekleyin. Ses seviyesini gerekli kuyucuk sayısına ayarlayın ve kabarcık yapmadan homojenize edin. Ardından, önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 50 mikrolitre ECM hücre süspansiyonu bulunan kuyucuklara bakın ve ECM'nin polimerizasyonu için 30 dakika boyunca inkübe edin.
Kuyu başına 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra her iki ila üç günde bir kültür ortamını inkübe edin ve değiştirin. Kültür ekini kaplamak için, soğuk PBS'de mililitre başına 50 mikrogramda seyreltilmiş kollajen IV içeren kaplama çözeltisini hazırlayın.
Her hücre kültürü ekine 150 mikrolitre seyreltilmiş kaplama çözeltisi ekleyin ve gece boyunca veya üç saat boyunca inkübe edin. Bölmeden beş gün sonra, organoidleri bir P-1000 pipetle kazıyarak ECM ile ayırın. Kültür ortamında pipetleme ile dikkatlice homojenize edilir ve buz üzerinde beş mililitre soğuk DMEMc içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarılır.
Toplanan organoidleri 500 x g'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre önceden ısıtılmış enzim ayrışma reaktifinde yeniden askıya alın. Organoidlerin ayrışmasını başlatmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipet.
Enzimatik sindirim için 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. 10 kez pipetleme yaparak organoidleri mekanik olarak bozun ve dört mililitre buz gibi soğuk DMEMc ekleyin. Organoid hücre peletini bir mililitre DMEMc'de yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın.
Bir hücre sayacı ile tripan mavisindeki hücreleri sayın ve kültür eki başına 2,5 kez 10 ila beşinci hücreyi tohumlamak için gerekli hacmi hesaplayın. Kültür eki başına beşinci hücrelerin 2,5 katı 10'a karşılık gelen hücre süspansiyonunun gerekli hacmini santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, kaplama çözeltisini kültür uçlarından dikkatlice aspire edin ve kapaksız kaputun altında beş dakika kurumasını bekleyin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş gerekli hacimde 2D ortamda yeniden askıya alın. Tohum 200 mikrolitre hücre süspansiyonu kaplanmış geçirgen membran üzerine serilir. Alt bölmeye 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 500 mikrolitre 2D ortam ekleyin ve inkübe edin.
Membran üzerinde yüksek bir hücre yoğunluğu gözlenmelidir. Tohumlamadan bir gün sonra, epik ve bazal ortamları ROCK inhibitörü olmadan taze 2D medya ile değiştirin. Medyayı her gün değiştirin.
Tek katman, tohumlamadan bir gün sonra birleşir ve deneyleri için kullanılabilir. Bu çalışmada, domuz bağırsağından epitel kriptleri elde edilmiş ve sıvı azotta uzun süreli depolama için kriyokorunmuştur. Çözüldükten sonra, kript kök hücreleri ECM'de tohumlandı.
Organoidler üç ila dört gün içinde gözlendi ve hızla büyüdü ve tomurcuklanan yapılar geliştirdi. Çözülmeden yaklaşık 10 gün sonra, kültürü genişletmek için organoidlerin geçişi yapıldı. Kültürün optimum bakımı için, paketleme için kullanılan organoidler, olgun organoidlerde gözlendiği gibi lümende siyah döküntü içermeyen berrak ve boş bir lümen ve iyi tanımlanmış kenarlar sunmalıdır.
Hücreler bir gün içinde bağlanır ve yaklaşık 700 kubbe santimetrekarelik yüksek transepitelyal elektrik direnci veya TEER ile doğrulanan tamamen birleşen bir tek katman oluşturur. TEER üç gün boyunca yüksek kalır. Aktin boyaması, epitel hücrelerinin apikal tarafının 3D organoidlerde lümene doğru yönlendirildiğini gösterir.
Kültür eklerinde tohumlanan organoid hücreler, apikal tarafı üst bölmeye doğru yönlendirilmiş olan tek bir epitel hücresi tabakası oluşturur. Oklüdin boyaması, 3D organoidlerde ve hücre monokatmanlarında epitel hücrelerinin apikal tarafında sıkı kavşakların varlığını ortaya koymaktadır. Hücre monokatmanlarını tohumlamak için kullanılan organoidin, ölü hücrelerin birikmesine karşılık gelen siyah döküntü olmadan boş bir lümen ile net görünmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.
Domuz bağırsak organoidinden elde edilen monokatmanlar, metabolitlerin veya mikropların epitel bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini fonksiyonel tahliller, görüntüleme ve gen ekspresyon analizi kullanarak test etmek için kullanılabilir.
