מימון: עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (32270538), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2022YFF0710603), הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (6222046), והמימון האסטרטגי של CAS באמצעות תוכנית המימון CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) שהוענק ל- G.H.W. תרומות מחברים: כל המחברים פיתחו את היקף ומיקוד הסקירה ותרמו לכתיבת כתב היד.

1. הכנתמדיום גידולנסוניה ללא חיידקים 
<ol><li>הניחו את הגלמים L. sericata הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים) על משטח שיכול להכיל את כל הגלמים כגון מגש או גיליון נייר. השליכו זחלים לא מפותחים, גלמים ישנים כהים, קליפות גולם ריקות, נסורת או זיהומים אחרים. החזיקו רק גלמים צעירים שצבעם חום-אדום והעבירו אותם לכד (כ-3,000-4,000 גלמים). הערה: לאחר ביצוע ניסויים רבים, נמצא כי התווך העשוי מהגלמים הישנים והכהים הפך בקלות לכהה ועצר את התפתחותן של צרעות נטולות חיידקים. תופעה זו לא התרחשה כאשר השתמשו בגלמים החומים-אדומים הצעירים לייצור מדיום. הסיבה לכך עדיין אינה ברורה ודורשת חקירה נוספת כדי לאמת אותה.</li>
	<li>הוסיפו מספיק מים נטולי יונים, כדי לכסות את כל פני השטח של הגלמים. לעטוף את הפה של הכד עם tinfoil או גזה, לנער את הכד כדי לנקות את הזיהומים על פני השטח של הגלמים, ולאחר מכן לשפוך את המים. חזור על הפעולה שלוש עד חמש פעמים.</li>
	<li>הניחו את הגלמים הנקיים של L. sericata במיכל הסינון של מכבש שום, סחטו חזק ואספו את נוזל הרקמה של הגלמים L. sericata בצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מ"ל. לאחר מכן, יוצקים את שאריות הגלמים ומכניסים גלמים חדשים למיכל הסינון של מכבש השום עד שכולם נסחטים. הערה: בהשוואה למכשיר שחול המחט המשמש את וואנג ואחרים 14, מכבש השום נוח יותר ויכול להפריד את נוזל האינטרסטיציאל בצורה יסודית יותר. התקדמות זו מניחה את היסודות לייצור בקנה מידה גדול ואחסון לטווח ארוך של NRM.</li>
	<li>צנטריפוגה את התערובת בטמפרטורה של 4°C (25,000 x גרם) למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, התערובת תופרד לשלוש שכבות מלמטה למעלה: שכבת משקעים, שכבת חלבון ושכבת שומן (איור 1).</li>
	<li>כדי למנוע סתימה במהלך הסינון, שאפו את שכבת החלבון באמצעות מחט סטרילית 18 גרם והעבירו אותה לצינור צנטריפוגה סטרילי חרוטי חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>הוסיפו מדיום דרוזופילה נוזלי מסחרי (ראו טבלת חומרים) לתמצית החלבון ביחס של 1:1. הערה: L. sericata ממוסחר נוח יותר שימש כחומר גלם מארח ו-NRM, בהשוואה ל-NRMv3. לכן, היחס התזונתי הותאם מ-1:2 ל-1:1 בהתבסס על NRMv3, שהיה מתאים יותר לגדילה ולהתפתחות של נסוניה סטרילית (איור 2).</li>
	<li>סנן את התווך המעורב (מדיום דרוזופילה ותמצית חלבון של L. sericata pupa) באמצעות מערכת סינון ואקום עם גדלי נקבוביות שונים (8, 1.2, 0.8 ו- 0.45 מיקרומטר; ראה טבלת חומרים) כדי להסיר חלקיקים בגדלים שונים. כדי למנוע סתימה, החלף את נייר הסינון כאשר הזרימה מאטה. הערה: השימוש בצינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל נדרש עבור כל סינון.</li>
	<li>צנטריפוגו את הנוזל שוב בטמפרטורה של 4°C (15,000 x g) למשך 10 דקות ועיקרו את התווך הסופרנאטנטי דרך מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר. חזור על השלבים לעיל פעם אחת.</li>
	<li>אחסנו את מדיום התרבית בטמפרטורה של -20°C לאחר הציטוט (איור 3A) לאחסון לטווח ארוך. הערה: כדי למנוע זיהום והקפאה והפשרה חוזרות ונשנות, מומלץ לפתוח כל צינורית של NRM פעם אחת בלבד בעת שימוש במדיום התרבית לאחר האריזה (איור 3A).</li>
</ol>2. איסוף ביצים ללא חיידקים
<ol><li>כדי להבטיח יחס יציב בין זכר לנקבה בצאצאים, הניחו את הגלמים בבקבוקון דרוזופילה בשלב הגלמים ביחס של 50 נקבות ל-15 זכרים בגלל המאפיינים הגנטיים ההפלואידים שלהם (זכרים מתפתחים מתאים הפלואידים, בעוד שהנקבות מתפתחות מתאים דיפלואידיים הנובעים מביציות מופרות)4,15.<ol><li>לאחר הגיחה לבוגרים, אפשרו לזכרים ולנקבות להזדווג במשך יום וחצי, ולאחר מכן הכניסו כ -40 גלמים L. sericata לתוך הבקבוקון. בתוך 12-24 שעות לאחר הטפילות, השתמשו במחט ניתוח סטרילית כדי לפתוח בזהירות קצה אחד של קליפת הגולם תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 4).</li>
		<li>החזיקו את הקצה השני ביד ומצאו את עוברי הצרעה. השתמש במחט ניתוח כדי להעביר עוברים מפני השטח של רקמת הגלמים L. sericata למסננת תאים סטרילית עם מלח חוצץ פוספט (PBS)14. הערה: יש להשתמש בגלמים ישנים יותר של L. sericata לטיפול בטפילות, מכיוון שרקמת L. sericata pupa היבשה קלה יותר להעברת עוברים. על מנת להבטיח העברה חלקה של ביצים משטח רקמת הגלמים L. sericata, נסו להיזהר שלא לנקב את הרקמה כאשר המחט המנותחת פותחת את מארז הגולם, כך שהנוזל הבין-תאי לא יזרום החוצה.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו 20-30 עוברים על מסננת תאים ושטפו אותם באופן שווה עם 1,000 μL של 10% תמיסת נתרן היפוכלוריט מסחרית (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן שטיפה נוספת עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד. לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת עם 1,000 μL של תמיסת אתנול 70% ולשטוף שלוש פעמים עם 1,000 μL של PBS סטרילי אחד.</li>
	<li>ראשית, הניחו יריעת רשת פוליפרופילן בקוטר 5 מ"מ (ראו טבלת חומרים) שהורטבה מראש עם PBS 1x לתוך צלחת בעלת 24 בארות. לאחר מכן, באמצעות מברשת קטנה מעוקרת, הברישו בעדינות את עוברי הצרעה על מסננת התאים על יריעת רשת הפוליפרופילן. ניתן לעשות זאת עבור כל ארבע הבארות בטור אנכי של צלחת 24 בארות.</li>
</ol>3. גידול צרעות ללא חיידקים
<ol><li>הוסף 50 μL של NRM לכל באר במכסה מנוע זרימה למינרית. כדי לשמור על סביבה לחה לצמיחה, הוסף 1 מ"ל מים סטריליים בין כל באר בצלחת 24 בארות. קטנה המכילה 30 מ"ל מים סטריליים יכולה להיות ממוקמת גם בקופסת הפלסטיק הסטרילית 5 L עם צלחת 24 בארות.<ol><li>לאורך כל הניסוי, שמרו את קופסת הפלסטיק הסטרילית ואת צלחת 24 הבארות בתא אקלים בטמפרטורה קבועה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ותחת אור קבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>לפני העברה והוספה של NRM מדי יום, הפשירו את ה-NRM הקפוא על ספסל זרימה למינרי. בסביבה סטרילית, השתמש בפינצטה מחוטאת אלכוהול כדי להעביר את רשת הפוליפרופילן עם הזחלים עליה מבאר אחת לאחרת. לבסוף, הוסיפו 50 מיקרוליטר של NRM ששוקל לטמפרטורת החדר (איור 3B). חזור על הפעולות הנ"ל כל יום עד שגלמים נצפים. הערה: עם התפתחות הצרעות, יש להגדיל את כמות ה-NRM כראוי כדי להבטיח שלצרעות נטולות חיידקים יש תזונה מספקת. לדוגמה, הזחלים הכוכבים הרביעי סופקו עם 60 עד 70 μL של NRM. מכיוון ששלבי התפתחות שונים עשויים להתקיים יחד באותה באר, השתמשו במברשת מעוקרת כדי להעביר את הגלמים החוצה. הוסיפו כמות קטנה של NRM לזחלים הנותרים. השתמש בטכניקות אספטיות כדי למנוע פלישה מיקרוביאלית וזיהום.</li>
	<li>לאחר האכלה במשך 9 עד 11 ימים, יותר מ -80% מהזחלים מתפתחים לגלמים לבנים או צהובים. בשלב זה, העבירו את הפילטר לצלחת באר נקייה והפסיקו להוסיף מדיום תרבית כדי להמתין לאקלוזיה.</li>
</ol>

גידול צרעות נסוניה , נטולות חיידקים

<ol>
	<li>Diviccaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+impact+of+the+microbiome+on+neuroactive+steroid+levels+in+germ-free+animals.">Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+transplantation+of+gut+microbiota+from+human+to+pigs.">Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs.</a> The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).</li><li>Uzbay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+animal+experiments+in+the+gut+microbiota+studies.">Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies.</a> Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).</li><li>Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonia-microbiome+associations:+a+model+for+evolutionary+hologenomics+research.">Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research.</a> Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).</li><li>Li, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+germ-free+animal+system+to+support+functional+microbiome+research.">Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research.</a> Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure.">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li><li>Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadaptation+between+host+genome+and+microbiome+under+long-term+xenobiotic-induced+selection.">Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Dittmer, J., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+your+host+shuts+down:+larval+diapause+impacts+host-microbiome+interactions+in+Nasonia+vitripennis.">When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis.</a> Microbiome. 9 (1), 85 (2021).</li><li>Dittmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+a+holobiont-recent+advances+and+perspectives+in+Nasonia+wasps.">Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).</li><li>Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylosymbiosis:+relationships+and+functional+effects+of+microbial+communities+across+host+evolutionary+history.">Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history.</a> PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).</li><li>Heavner, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+venom+gland+transcriptome+of+a+Drosophila+parasitoid+wasp,+Leptopilina+heterotoma,+reveals+novel+and+shared+bioactive+profiles+with+stinging+Hymenoptera.">Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera.</a> Gene. 526 (2), 195-204 (2013).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+the+hymenoptera+genetic+model,+Nasonia.">In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia.</a> PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).</li><li>Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+approach+to+germ-free+rearing+in+the+jewel+wasp+Nasonia.">An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia.</a> PeerJ. 4, e2316 (2016).</li><li>Wang, G. H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing.">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hologenomic+basis+of+speciation:+gut+bacteria+cause+hybrid+lethality+in+the+genus+Nasonia.">The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia.</a> Science. 341 (6146), 667-669 (2013).</li><li>Fontaine, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+free+of+germs+is+germ-free?+Detection+of+bacterial+contamination+in+a+germ+free+mouse+unit.">How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit.</a> Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).</li><li>Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunomodulatory+molecule+of+symbiotic+bacteria+directs+maturation+of+the+host+immune+system.">An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system.</a> Cell. 122 (1), 107-118 (2005).</li><li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome.">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עם היישום של טכנולוגיות זיהוי תפוקה גבוהה כגון גנומיקה ומטבולומיקה, חוקרים הבינו בהדרגה שיש מגוון גנטי עצום ומורכבות מטבולית במיקרוביוטה של המעי16. חיידקים סימביוטיים אלה קשורים קשר הדוק למצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים, כגון מטבוליזם תזונתי של המאכסן, גידולים, חסינות ?...

בעלי חיים נטולי חיידקים הם בעלי חיים שאין להם מיקרואורגניזמים חיים וטפילים הניתנים לזיהוי1. ניתן להשיג עוברים נטולי חיידקים על ידי ניתוח האם בתנאים אספטיים ולאחר מכן לגדלם במערכות מחסום2. בעלי חיים כאלה יכולים לשמש לחקר ההשפעות של מיקרואורגניזמים על בעלי חיים, כגון על המיקרוביוטה של המעי, מערכת החיסון וחילוף החומרים1. באמצעים טכניים מסוימים, חרקים רבים ואפילו יונקים יכולים להפוך לסטריליים 3,4. לבעלי חיים נטולי חיידקים יש תפקיד ייחודי והם נמצאים בשימוש נרחב בהיבטים שונים של מחקר מיקרוביולוגי5. לדוגמה, השימוש בצרעות Nasonia נטולות חיידקים גילה כי מיקרואורגניזמים יכולים לעזור למארחים להסתגל לסביבות חדשות תחת לחץ סביבתי אקסוגני ארוך טווח 6,7.
טפילי נסוניה הם צרעות טפיליות קטנות המזריקות את ביציהן לגלמים של זבובים4. ישנם ארבעה מינים ידועים של נסוניה, כולל Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ו- Nasonia oneida8. ניתן למצוא N. vitripennis ברחבי העולם, בעוד שלשלושת המינים האחרים יש טווח מוגבל בצפון אמריקה4. צרעות טפיליות נסוניה נחשבות לחרקים מודל אידיאליים בגלל המאפיינים שלהן, כגון גידול קל, מחזור רבייה קצר, רצף גנום ודיאפאוזה 8,9 לטווח ארוך. ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של אבולוציה של חרקים, גנטיקה, התפתחות, התנהגות וסימביוזה10. יתר על כן, צרעות טפיליות נסוניה יכולות גם לסייע בהדברת זבובים מזיקים בחקלאות ובמחלות11. הקמתה המוצלחת של מערכת חרקים סטרילית כרוכה בשני שלבים עיקריים: (1) עיקור העוברים ו-(2) אספקת מזון סטרילי לזחלים במבחנה. על מנת להשיג מזון סטרילי, ברוקר ובורדנשטיין 12 פיתחו מדיום גידול נסוניה (NRMv1) בשנת 2012 על ידי שימוש בכימיקלים כגון אנטיביוטיקה, אקונומיקה וסרום בקר עוברי כדי להרוג חיידקים12. עם זאת, שיטת העיקור הכימי הביאה לשיעורי הישרדות ואקלוסיה נמוכים של N. vitripennis13. לאחר מכן, בשנת 2016, Shropshire et al. פיתחו את NRMv2 באמצעות שיטת עיקור מסנן במקום שיטת עיקור כימי כדי לחסל את הסיכונים של אנטיביוטיקה וחומרים אחרים, וייעלו את תהליך הרבייה13. למרבה הצער, לשיטה זו יש עדיין כמה חסרונות, כגון האתגרים הקשורים להכנת המדיום והשימוש בו, כמו גם הסיכונים לטביעה, תת-האכלה או התייבשות עבור העוברים, הזחלים והגלמים הסגורים14. וואנג וברוקר14 שיפרו לאחרונה את גרסת המדיה לגידול Nasonia גרסה 3 (NRMv3) ואת פרוטוקולי הגרסה 2 (GFRv2) לגידול ללא חיידקים. שיפורים אלה הפחיתו את העלות ואת צריכת המדיה. עם זאת, ל-NRMv3 יש זמן אחסון קצר מאוד והוא רגיש מאוד לזיהום.
בהתבסס על NRMv3, שיטת אחסון כלי ההכנה של NRM ויחס החומרים המזינים עברו אופטימיזציה במחקר זה. עידון מתודולוגי זה מאפשר שימוש ב-N. vitripennis כמודל למחקרי מיקרוביום. בהשוואה ל- NRMv3 שפותח על ידי וואנג ואחרים 14, הכלי המשופר לסחיטת סרקופגה בולטה גולם, אחד מחומרי הגלם של NRM, משפר מאוד את יעילות הייצור של נוזל רקמת S. bullata pupa בהשוואה למזרק 60 מ"ל עם חור תחתון המשמש את וואנג ואחרים 14. התאמנו את יחס החומרים המזינים של NRM, מה שהוביל לעלייה מסוימת בשיעור ההישרדות של צרעות נסוניה נטולות חיידקים מבלי להשפיע על זמן ההתפתחות שלהן. בנוסף, ה-NRM נארז בצינורות צנטריפוגות בעלי קיבולת קטנה (1.5 מ"ל) והוקפא במקרר בטמפרטורה של -20°C כדי להאריך את זמן האחסון. ראוי לציין כי בעוד שהשתמשנו בזבוב הבית Lucilia sericata כמארח וכמקור להכנת NRM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ככל הנראה למארחי Nasonia אחרים הזמינים במעבדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 Sterile vacuum filter</td>
			<td>NEST</td>
			<td>331011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SodiumHypochlorite</td>
			<td>LIRCON</td>
			<td>XB-84BS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh nylon net</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>BY-378Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24&#160;well-plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8, 1.2, 0.8, and 0.45 &#181;m filters</td>
			<td>Shanghai Xingya Purification Material Factory</td>
			<td>HN-AA-JT-10079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethyl alcohol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E809057-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BIOLOGIX</td>
			<td>15-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Drosophila Medium</td>
			<td>Boer</td>
			<td>B645446-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic press</td>
			<td>Taobao</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucillia sericata pupae</td>
			<td>Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small writing brush</td>
			<td>Cestidur</td>
			<td>BL0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>RX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SALMART</td>
			<td>A109001-56</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the rearing procedure of germ-free wasps

טכנולוגיית גידול אספטי היא שיטה לגידול חרקים בתנאים סטריליים או כמעט סטריליים, אשר יכולה לחסל ביעילות את ההשפעה של מיקרואורגניזמים חיצוניים על מיקרוביוטה של חרקים ובכך לקדם את ההתפתחות המהירה של מחקר מיקרוביוטה חרקים. נסוניה (סוג צרעה) הוא חרק צרעה טפילי בעל יתרונות רבים, כגון תוחלת חיים קצרה, שונות גנטית גבוהה, תפעול קל ועוד, ונמצא בשימוש נרחב כמערכת מודל חרקים. שלא כמו טיפול אנטיביוטי, אשר יכול רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים בבעלי חיים, טכניקות גידול אספטיות יכולות לשלוט הן על הרכב וכמות מיקרואורגניזמים בבעלי חיים, מה שמקל עוד יותר על המחקר של אינטראקציות מיקרואורגניזם מארח. עם זאת, גרסאות קודמות של מדיום גידול Nasonia (NRM) יש כמה פגמים ובעיות, כגון תהליך הכנה מורכב וגוזל זמן, זיהום קל על ידי חיידקים או פטריות, וזמן אחסון קצר. לכן, מחקר זה פותר בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של הכלים המשמשים בתהליך הכנת NRM, תנאי אחסון ויחסי רכיבים. התווך הממוטב יכול לאפשר אחסון בטמפרטורה של -20°C למשך 3 חודשים לפחות ולמנוע את האפשרות של זיהום NRM במהלך האכלת צרעות סטריליות. זה משפר עוד יותר את שיעור ההישרדות ואת רמת הבריאות של Nasonia אספטית, אשר חשוב לשימוש Nasonia כמודל למחקר מיקרוביאלי.

Germ-free animals are animals that have no detectable living microorganisms and parasites1. Germ-free embryos can be obtained by dissecting the mother under aseptic conditions and subsequently raised in barrier systems2. Such animals can be used to study the effects of microorganisms on animals, such as on the intestinal microbiota, immune system, and metabolism1. With certain technical means, many insects and even mammals can be rendered sterile3,4. Germ-free animals have a unique role and have been widely used in various aspects of microbiology research5. For example, the use of germ-free Nasonia wasps has revealed that microorganisms can help hosts adapt to new environments under long-term exogenous environmental stress6,7.
Nasonia parasitoids are small parasitic wasps that inject their eggs into the pupae of flies4. There are four known species of Nasonia, including Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti, and Nasonia oneida8. N. vitripennis can be found worldwide, while the other three species have limited ranges in North America4. Nasonia parasitoid wasps are regarded as ideal model insects because of their characteristics, such as easy cultivation, short reproduction cycle, sequenced genome, and long term diapause8,9. They can be used to study various aspects of insect evolution, genetics, development, behavior, and symbiosis10. Moreover, Nasonia parasitoid wasps can also help control harmful flies in agriculture and disease11. The successful establishment of a sterile insect system involves two major steps: (1) sterilization of the embryos and (2) provision of sterile food to the larvae in vitro. In order to obtain sterile food, Brucker and Bordenstein12 developed Nasonia rearing medium (NRMv1) in 2012 by using chemicals such as antibiotics, bleach, and fetal bovine serum to kill bacteria12. However, the chemical sterilization method resulted in low survival and eclosion rates of N. vitripennis13. Then, in 2016, Shropshire et al. developed NRMv2 by using a filter sterilization method instead of a chemical sterilization method to eliminate the hazards of antibiotics and other substances, and optimized the breeding process13. Unfortunately, this method still has some disadvantages, such as the challenges associated with preparing and using the medium, as well as the risks of drowning, underfeeding, or dehydration for the embryos, larvae, and closed pupae14. Wang and Brucker14 recently improved the Nasonia rearing media version 3 (NRMv3) and the germ-free rearing version 2 (GFRv2) protocols. These improvements reduced the cost and media consumption. However, the NRMv3 has a very short storage time and is highly susceptible to contamination.
Building on NRMv3, the NRM preparation tool storage method and nutrient ratio were optimized in this study. This methodological refinement facilitates using N. vitripennis as a model for microbiome studies. Compared with the NRMv3 developed by Wang et al.14, the improved tool for squeezing Sarcophaga bullata pupa, one of the NRM raw materials, greatly enhances the production efficiency of S. bullata pupa tissue fluid compared with the 60 mL syringe with a bottom hole used by Wang et al.14. We adjusted the nutrient ratio of NRM, which led to a certain increase in the survival rate of germ-free Nasonia wasps without affecting their development time. In addition, the NRM was packed into small-capacity centrifuge tubes (1.5 mL) and frozen in a -20 &#176;C refrigerator to extend the storage time. It is worth noting that while we used the housefly Lucilia sericata as the host and source for NRM preparation, this protocol can likely be adapted for other Nasonia hosts that are available in the laboratory.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות ללא חיידקים  

אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים

Our research focuses on the study of insect-microbiota interactions, specifically investigating the impact of in those symbiotic bacteria and exploring the dynamics of host-microbe relationships. Germ-free Nasonia is an essential tool for conducting this research. Current research utilize technologies such as high-throughput sequencing, germ-free insect rearing, transcriptoptomics, proteomics, and advanced microscope.This tool enable comprehensive analysis and virtualization of insect-microbe host interaction for advancing our understanding of this field. The optimized the procedure for preparing the Nasonia Rearing Medium provides economic advantages and saves time and effort. Additionally, it effectively reduces the risk of NRM contamination during the feeding process, greatly improving the efficiency of producing aseptic Nasonia

יעילות ההכנה של NRM שופרה מאוד על ידי שיפור כלי ההכנה. בנוסף, בעיית זיהום NRM בתהליך ההזנה בוטלה על ידי אופטימיזציה של האסטרטגיה ושיטת השימור. יחד עם זאת, ל-NRM המותאם היה יחס תזונתי מתאים יותר לגדילה והתפתחות של צרעות נטולות חיידקים עם L. sericata כפונדקאים. שיעור ההישרדות של צרעות נטולות חיידק...

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps at JoVE.com

עוברי צרעת נסוניה נותחו מגלמי Lucillia sericata לאחר טפילים במשך 12-24 שעות ונשטפו בתמיסת אלכוהול ונתרן היפוכלוריט 10% כדי להשיג עוברים נטולי חיידקים. לאחר גידול העוברים נטולי הנבט ואספקת מצע גידול נסוניה, כדי לגדול ולהתפתח במבחנה, התקבלו בוגרים נטולי חיידקים של נסוניה.

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

המחקר שלנו מתמקד בחקר אינטראקציות בין חרקים למיקרוביוטה, ובמיוחד חוקר את ההשפעה של חיידקים סימביוטיים אלה וחוקר את הדינמיקה של יחסי מיקרוב מארח. נסוניה נטולת חיידקים היא כלי חיוני לביצוע מחקר זה. המחקר הנוכחי משתמש בטכנולוגיות כגון ריצוף בתפוקה גבוהה, גידול חרקים ללא חיידקים, שעתוק, פרוטאומיקה ומיקרוסקופ מתקדם.כלי זה מאפשר ניתוח מקיף ווירטואליזציה של אינטראקציה בין חרקים לפונדקאים לקידום הבנתנו בתחום. ההליך האופטימלי להכנת מדיום הגידול של נסוניה, מספק יתרונות כלכליים וחוסך זמן ומאמץ. בנוסף, זה מפחית ביעילות את הסיכון של זיהום NRM במהלך תהליך ההאכלה, שיפור משמעותי את היעילות של ייצור Nasonia אספטית

optimizing-the-rearing-procedure-of-germ-free-wasps

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

1.3K Views.  Chinese Academy of Sciences. המחקר שלנו מתמקד בחקר אינטראקציות בין חרקים למיקרוביוטה, ובמיוחד חוקר את ההשפעה של חיידקים סימביוטיים אלה וחוקר את הדינמיקה של יחסי מיקרוב מארח. נסוניה נטולת חיידקים היא כלי חיוני לביצוע מחקר זה. המחקר הנוכחי משתמש בטכנולוגיות כגון ריצוף בתפוקה גבוהה, גידול חרקים ללא חייד...

Video: מחבר זרקור: אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות ללא חיידקים  

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of external microorganisms on insect microbiota and thus promote the rapid development of insect microbiota research. Nasonia (wasp genus) is a parasitic wasp insect that has many advantages, such as a short lifespan, high genetic variation, easy operation, etc., and is widely used as an insect model system. Unlike antibiotic treatment, which can only reduce the number of microorganisms in animals, aseptic rearing techniques can control both the composition and quantity of microorganisms in animals, further facilitating the study of host-microbe interactions. However, previous versions of Nasonia rearing medium (NRM) have some defects and problems, such as a complex and time-consuming preparation process, easy contamination by bacteria or fungi, and short storage time. Therefore, this study solves these problems by optimizing the tools used in the NRM preparation process, storage conditions, and component ratios. The optimized medium could allow storage at -20 &#176;C for at least 3 months and eliminate the possibility of NRM contamination during feeding sterile wasps. This further improves the survival rate and health level of aseptic Nasonia, which is important for using Nasonia as a model for microbial research.

Nasonia wasp embryos were dissected from Lucillia sericata pupae after parasitization for 12-24 h and washed with alcohol and 10% sodium hypochlorite solution to obtain germ-free embryos. After rearing the germ-free embryos&#160;and supplying them with Nasonia rearing medium to grow and develop in vitro, germ-free Nasonia adults were obtained.

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)  

To begin, place commercially available Lucillia sericata pupae on a sheet of paper. Discard any underdeveloped larvae, dark old pupae, empty pupil shells, sawdust, or other impurities. Transfer young brownish red colored pupae to a beaker and immerse the pupae in deionized water.Wrap the beaker with tinfoil or gauze and shake it to clean any surface impurities off the pupae. Then discard the water. Place the cleaned pupae in the filter tank of a garlic press, and squeeze hard.Then collect the pupae tissue fluid in a 50-millimeter sterile centrifuge tube, and centrifuge it at 25, 000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius. Using a 22-gauge sterile needle, collect the protein layer into a new 50-millimeter polypropylene centrifuge tube, and add commercial liquid drosophila medium at an equal ratio to the protein extract. To remove the particles of different sizes from the mixture, filter it using a vacuum filtration system with filter paper of different pore sizes.To prevent clogging change the filter paper when the flow slows down. Once the filtrate is centrifuged, sterilize the supernatant through a 0.22 micrometer syringe filter, and store the prepared nasonia rearing medium, or NRM aliquots, at 20 degrees Celsius until further use.

הכנת מדיום גידול נסוניה ללא חיידקים (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)  

To begin, parasitize about 40 Lucilia sericata pupae onto emerging adult male and female Nasonia wasps mated for 1.5 days. Within 12 to 24 hours after parasitization, carefully open one end of the pupal shell using a sterile dissecting needle. Hold the other end of the shell and locate the wasp embryo.Then transfer the embryo to a sterile cell strainer moistened with PBS. Once 20 to 30 embryos have been transferred, wash them with 1, 000 microliters of 10%sodium hypochlorite solution followed by sterile PBS and 70%ethanol. Finally, wash them three times with sterile PBS.Next, place a polypropylene mesh sheet pre-wetted with PBS into a 24 well plate. Using a sterilized small brush, gently transfer the wasp embryos from the cell strainer to the polypropylene mesh sheet. For the wasp rearing, add 50 microliters of prepared NRM to each well with a sheet.Then add one milliliter of sterile water between each well to maintain a humid environment for growth. The next day, transfer the polypropylene mesh containing the larva from one well to another well using alcohol disinfected tweezers, and add 50 microliters of equilibrated NRM. After nine to 11 days of feeding, over 80%of the larva should develop into white or yellow pupae.then transfer the mesh to a clean well plate. In the present study, the survival rate of the germ-free wasps from larva to pupae was significantly improved compared to rearing germ-free wasps with NRM version three. Additionally, there was no difference in the generation period between the germ-free and conventionally reared wasps.