מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).

1. הכנה
<ol><li>טיפול לדוגמה<ol><li>בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.</li>
		<li>הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).</li>
		<li>להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.</li>
		<li>צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
	</ol></li>
	<li>משקעים חלבוניים<ol><li>מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר.</li>
		<li>צנטריפוגה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את משקע החלבון; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>תרחיף חלבונים<ol><li>להשהות מחדש את משקע החלבון עם 30 מ"ל של מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4). אחסנו את תמיסת החלבון הגולמי בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כרומטוגרפיית זיקה
<ol><li>סינון פתרונות<ol><li>סנן את תמיסת החלבון הגולמי דרך קרום מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן דגימה זו בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>אריזת עמודות<ol><li>ארוז את עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז ואת עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין-אגרוז על ידי טעינת כמות מתאימה של מדיום מטריצת ליזין-אגרוז ומדיום מטריצת ארגינין-אגרוז לעמודות כרומטוגרפיה ריקות של 5 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את העמודה בטמפרטורה של 2-8°C, כאשר המטריצה שקועה במאגר האחסון (20% אתנול).</li>
	</ol></li>
	<li>טיהור אהדה<ol><li>אזן את עמודת כרומטוגרפיית הזיקה עם ddH2O תחילה (1 מ"ל/דקה, 10 כרכים של עמודות), ואחריו מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, 1 מ"ל/דקה, 5 אמצעי אחסון).</li>
		<li>טען את דגימת תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת מראש (1 מ"ל/דקה, נפח של 1/3 עמודה). הערה: נפח טעינת הדגימה תלוי בריכוז sFE.</li>
		<li>שטוף את העמודה באמצעות מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, חמישה כרכי עמודות).</li>
		<li>הצביעו על העמוד ברצף באורך 0.15 מ', 0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (1 מ"ל/דקה, חמישה כרכי עמודות).</li>
		<li>חפש את שיא האלוציה שאמור להופיע ב- 0.15 M NaCl elution, ולאחר מכן אסוף את השברים בצינורות 5 מ"ל.</li>
		<li>רכז את דגימת האלוציה באמצעות מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3 kD (3,944 × גרם, 1.5 שעות, 4 ° C). אחסן דגימה זו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הערכת טוהר
<ol><li>נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל הכנה<ol><li>הכינו את ג'ל SDS-PAGE לפי השיטה של Laemmli באמצעות 5% ג'ל מרוכז ו-12% ג'ל הפרדה13.</li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה<ol><li>ערבבו את הדגימה (15 מיקרוליטר) עם מאגר העמסת חלבון 5x SDS-PAGE (1/4 נפח), חממו במים רותחים למשך 5 דקות, טענו על ג'ל SDS-PAGE והפעילו את הג'ל במתח של 80 וולט, 60 מיליאמפר למשך שעה וחצי.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח<ol><li>לאחר אלקטרופורזה יש לצבוע את הג'ל בערכת כתמים כסופה, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ולצפות בג'ל המוכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית.</li>
		<li>נתח את טוהר חלבון המטרה באמצעות הנוסחה הבאה: טוהר חלבון המטרה = ערך העוצמה של חלבון המטרה / ערך העוצמה של סך החלבון.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הערכת פעילות פיברינוליטית
<ol><li>הכנת צלחת פיברין<ol><li>הכן את הפתרון פיברינוגן על ידי ערבוב 25 מ"ג של פיברינוגן עם 1.25 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.</li>
		<li>הכן את פתרון תרומבין על ידי ערבוב מלא 100 U של תרומבין עם 1.05 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.</li>
		<li>הכן את תמיסת האגרוז על ידי הוספת 0.5 גרם אגרוז ל 22.5 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.4). מערבבים ומחממים את תמיסת האגרוז ב-100°C עד להמסה מלאה.</li>
		<li>מצננים את תמיסת האגרוז עד לסביבות 50°C ומוסיפים תמיסת פיברינוגן. לאחר מכן, מיד להוסיף את פתרון טרומבין, לערבב אותם במהירות, ויוצקים אותם לתוך צלחת תרבית 60 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת<ol><li>ניקבו בארות 3 מ"מ על לוחות הפיברין המוכנים באמצעות בורר סטרילי ומלאו את הבארות בדגימות 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח<ol><li>לאחר 18 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, למדוד את הפעילות הפיברינוליטית על ידי חישוב גודל האזורים השפלה שלהם. פעילות פיברינוליטית = (גודל אזור הדגימה / גודל אזור האורוקינאז) x 100 U. גודל אזור = קוטר x קוטר. הערה: חיץ מלח פיזיולוגי, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בשלב פרוטוקול 1.3.1) ואורוקינאז שימשו לבקרה הריקה, השלילית והחיובית, בהתאמה. בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL.</li>
	</ol></li>
</ol>

טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16<sup class="x...

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים5. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)6. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים 7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב10.
בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.
כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

מחבר זרקור: זיקה טיהור של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus  

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

Our research is mainly about the purification of fibrinolytic enzyme. This work tries to establish a simple purification method for fibrinolytic enzyme. In this work, we report an arginine or lysine best-affinity purification system of fibrinolytic enzyme for the first time.Compared with the conventional purification methods, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for the purification of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus. The development of this protocol is of greater significance for the further utilization of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus and other similar agents.

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.
לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. ה...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus at JoVE.com

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

המחקר שלנו עוסק בעיקר בטיהור אנזים פיברינוליטי. עבודה זו מנסה להקים שיטת טיהור פשוטה עבור אנזים פיברינוליטי. בעבודה זו, אנו מדווחים לראשונה על מערכת טיהור ארגינין או ליזין בעלת הזיקה הטובה ביותר של אנזים פיברינוליטי.בהשוואה לשיטות הטיהור הקונבנציונליות, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus. לפיתוח פרוטוקול זה יש משמעות רבה יותר לניצול נוסף של אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus וחומרים דומים אחרים.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

1.2K Views.  Huaqiao University. המחקר שלנו עוסק בעיקר בטיהור אנזים פיברינוליטי. עבודה זו מנסה להקים שיטת טיהור פשוטה עבור אנזים פיברינוליטי. בעבודה זו, אנו מדווחים לראשונה על מערכת טיהור ארגינין או ליזין בעלת הזיקה הטובה ביותר של אנזים פיברינוליטי.בהשוואה לשיטות הטיהור הקונבנציונליות, זוהי גישה פשו?...

Video: מחבר זרקור: זיקה טיהור של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus  

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

Protein Isolation from Sipunculus nudus

Protein Isolation from Sipunculus nudus  

Begin the sample treatment by dissecting 100 grams of fresh Sipunculus nudus and collecting their intestine and inner fluid.Add 300 milliliters of Tris hydrochloride buffer and homogenize at 1000 RPM for 60 seconds.Freeze thaw the homogenate three times.After centrifuging the freeze thawed homogenate, collect the supernatant and store it at 4

בידוד חלבונים מ-Sipunculus nudus

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts 

Filter the crude proteins extracted from the Sipunculus nudus intestine through a 0.22-micrometer filter membrane. Store this sample at four degrees Celsius for later use. Pack the arginine agarose matrix affinity chromatography column by loading the arginine agarose matrix medium into a five-milliliter empty chromatography column.Similarly, load the lysine agarose matrix affinity chromatography column by loading the lysine agarose matrix medium into an empty chromatography column. Equilibrate the affinity chromatography columns with double-distilled water followed by tris hydrochloride buffer. Load the filtered protein sample onto the pre-equilibrated column.Wash the column with five volumes of 0.02-molar tris hydrochloride buffer before eluting it with 0.15-0.25-0.35-0.45-0.55-and 0.65-molar sodium chloride solutions, successively. Once the elution peak appears in the 0.15-molar sodium chloride elution, collect the fractions in five-milliliter tubes. Concentrate the elution sample using a three-kilodalton ultracentrifugal filter and store this sample at minus 80 degrees Celsius for later use.When the protein solution was loaded onto the arginine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 40 to 66 minutes. In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from approximately 94 to 110 minutes. When the protein solution was loaded to the lysine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 38 to 60 minutes.In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from 80 to 86 minutes.

כרומטוגרפיית זיקה טיהור אנזימים פיברינוליטיים מתווכים מתמציות חלבון גולמי 

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from Sipunculus nudus

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from  Sipunculus nudus  

Begin the fibrin plate preparation by mixing 25 milligrams of fibrinogen with 1.25 milliliters of physiological saline. Next, prepare the thrombin solution by thoroughly mixing 100 units of thrombin with 1.05 milliliters of physiological saline. Then, prepare the agarose solution by adding 0.5 grams of agarose to 22.5 milliliters of 0.02 molar Tris-hydrochloride acid buffer.Heat the agarose solution at 100 degrees Celsius until it dissolves completely. Cool the agarose solution to around 50 degrees Celsius before adding the fibrinogen solution to it. Immediately add the thrombin solution, mix rapidly, and pour the mixture into a 60-millimeter culture dish.To load the sample, punch three-millimeter wells into the fibrin plates using a sterile Boer, and fill them with 10 microliters of samples. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for 18 hours before measuring the size of their degrading zones and calculating the fibrinolytic activity. Fibrinolytic activity evaluation showed a 1.3-centimeter lysing zone in the urokinase control, no lysing zone in the physiological saline buffer, 2.1 centimeters of the lysing zone in the crude protein well, and 1.8 centimeters diameter of the lysing zone in the purified fibrinolytic enzyme well.