עבודה זו נתמכה על ידי R35GM128873 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע 2045493 (שהוענקה ל-M.N.M). מייגן ניקול מקלין, Ph.D. מחזיקה בפרס קריירה בממשק המדעי מקרן Burroughs Wellcome. Z.P.H. נתמך על ידי מענק הכשרה של NHGRI לתוכנית ההכשרה למדעים גנומיים 5T32HG002760. אנו מודים על דיונים פוריים עם חברי מעבדת McClean, ובמיוחד, אנו אסירי תודה לקירן סוויני על מתן הערות על כתב היד.

זני השמרים בהם נעשה שימוש במחקר זה מתועדים בטבלת החומרים. זנים אלה מציגים צמיחה חזקה בטווח הטמפרטורות של 22 °C (75 °F) עד 30 °C (75 °F) וניתן לגדל אותם במצעי שמרים סטנדרטיים שונים.
1. הגדרת תחנת העבודה לאוטומציה
<ol><li>ציידו את תחנת העבודה האוטומטית בזרוע אחיזה רובוטית (RGA, ראו טבלת חומרים) המסוגלת להזיז לוחות מיקרו-באר (איור 1).</li>
	<li>התקינו שייקר מחמם מיקרו-פלטות (ראו טבלת חומרים) בתחנת העבודה האוטומטית (איור 1(1)) עם מנגנון נעילת לוחות אוטומטי המספק גישת RGA.</li>
	<li>מקם קורא מיקרו-לוחות בסמוך לתחנת העבודה האוטומטית (איור 1(2)), כדי להבטיח נגישות RGA.</li>
	<li>שלבו התקן תאורת מיקרו-פלטה (איור 1(3)) המאפשר גישה נוחה ל-RGA. דוגמאות לכך כוללות את optoPlate8 (כפי שנעשה בו שימוש במחקר זה) או LITOS9 (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>2. הכנת מכשיר התאורה
<ol><li>בנה וכייל את optoPlate (או התקן תאורה חלופי) בהתאם לשיטות מבוססות 8,10,11.</li>
	<li>השתמש במתאם בהתקן התאורה כדי לאפשר גישת RGA.</li>
	<li>תכנת את optoPlate באמצעות קלט גיליון אלקטרוני10 או ממשק גרפי12. בצע את שלב 3 כדי להפעיל את התוכניות לגירוי אור.</li>
</ol>3. תכנון תוכנית לגירוי אור
<ol><li>קבע את תנאי האור הרצויים לניסוי.</li>
	<li>הזן את תנאי האור הרצויים, כולל עוצמת האור, זמן התחלת האור, אורך הפולס, מספר הפולס ומשך האינטרפולס, לתוך גיליון אלקטרוני. הערה: מהבהב מידע זה אל optoPlate באמצעות ההוראות המופיעות במאגר GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. זכור כי צלחת הדגימה לא תהיה מוארת כאשר הוא נמצא בקורא microplate או על שייקר התנור. משך ותדירות האירועים הללו עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתבסס על דרישות ניסוי ספציפיות.</li>
	<li>כלול תנאים כהים עבור כל זן כדי לאפשר מדידות רקע נאותות.</li>
	<li>עבור ניסויי אפיון ראשוניים להערכת פונקציונליות טרנספורמנטית, השתמש בעוצמת אור גבוהה. הערה: עוצמת האור צריכה להיות אופטימלית לניסויים רגישים יותר, מכיוון שעודף אור יכול להיות פוטוטוקסי לשמרים13.</li>
</ol>4. הכנת קורא microplate
<ol><li>הגדר את קורא המיקרו-צלחות כדי למדוד את כמות העניין הרצויה לפני ביצוע ניסויים. הערה: בדוגמה זו, קורא המיקרו-צלחות הוגדר למדוד פלואורסצנטיות של כתב המובע על-ידי זן העניין. ניתן להשתמש ביציאות אחרות, כגון עוצמת אור או צפיפות אופטית, בהתאם לדרישות הניסוי.</li>
	<li>טפח את הזן המעניין (יחד עם בקרה לא פלואורסצנטית) במדיה סינתטית שלמה (SC)14 (או מדיה פלואורסצנטית נמוכה אחרת) (ראה טבלת חומרים) לצפיפות התא הגבוהה ביותר שיש למדוד. העבירו את התרביות לצלחת מיקרווול בעלת תחתית זכוכית שחורה (ראו טבלת חומרים) ומדדו אותן כדי לקבוע את הגדרות קורא המיקרו-צלחות האופטימליות. הערה: ודא קריאות מדויקות על-ידי הזנה נכונה של מידות הלוח ומדידת הלוח מלמטה.</li>
	<li>עיין במסד נתונים של חלבונים פלואורסצנטיים (לדוגמה, fpbase.org) כדי לקבל ספקטרום בליעה ופליטה משוער עבור חלבון היעד הפלואורסצנטי15.</li>
	<li>קבע את ערך z (המרחק בין הלוח לקורא) על ידי ביצוע סריקת z על בארות המכילות את הזנים הפלואורסצנטיים והלא פלואורסצנטיים. בחר בערך z שמפיק את יחס האות לרעש הגבוה ביותר.</li>
	<li>מטב את ספקטרום הספיגה והפליטה על ידי ביצוע סריקות בליעה ופליטה על הזנים הפלואורסצנטיים והלא פלואורסצנטיים כדי לקבוע את יחס האות לרעש האופטימלי.</li>
	<li>מדוד את המאמץ הפלואורסצנטי עם הגדרת הרווח לרמה האופטימלית, וקבע את הרווח האופטי הגבוה ביותר שניתן להשתמש בו מבלי לגרום לשגיאת מדידת גלישה. הערה: יש להגדיר רווח אופטי זה באופן ידני באופן עקבי בניסויים הכוללים את אותו זן כדי להבטיח עקביות של התוצאות.</li>
	<li>הכינו סקריפט מדידה (ראו איור 2) בתוכנת קורא המיקרו-לוחות. סקריפט זה מגדיר את המכשיר למדידת הצפיפות האופטית של התרביות ואת ספקטרום הפלואורסצנטיות של כל החלבונים הפלואורסצנטיים שיש למדוד. הערה: מדוד את הצפיפות האופטית של זנים ב- 600 ננומטר, אלא אם כן הם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים. עבור זנים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים, מדדו את הצפיפות האופטית ב-700 ננומטר כדי למנוע הטיה16.</li>
	<li>הגדר את סקריפט המדידה כדי לשמור על טמפרטורת דגירה פנימית של 30 ° C במהלך המדידות.</li>
	<li>הגדר את סקריפט המדידה לייצוא הנתונים לגיליון אלקטרוני או לקובצי ASCII, בהתאם להעדפה.</li>
</ol>5. תכנות הרובוט
<ol><li>הגדר את הגדרת שולחן העבודה בתוכנת תחנת העבודה האוטומטית בהתבסס על הפריסה הפיזית של המנשאים (לדוגמה, מטלטלי חימום, פלטפורמות קן, התקני תאורה) וכלי המעבדה (כלומר, צלחת 96 הקידוחים) (ראה טבלת חומרים). צור סקריפט בתוכנת תחנת העבודה לאוטומציה כדי לבצע אינדוקציה ומדידות של אור (איור 3), לפי השלבים הבאים.</li>
	<li>השבת מקורות תאורה פנימיים כדי למנוע הפעלת רקע של מערכות אופטוגנטיות.</li>
	<li>כוונו את שייקר החימום כך שישמור על טמפרטורה של 30°C. כאשר הצלחת אינה על שייקר החימום, היא תהיה בטמפרטורת הסביבה (22 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>השתמש בלולאות, טיימר ומשתנה ספירת לולאה כדי לחזור על השלבים של השראת התאים ומדידתם במרווחי זמן קבועים.</li>
	<li>לפני הקלטת המדידות, נערו את צלחת הדגימה כדי להבטיח השעיה נאותה של כל התאים. רעידה של 60 שניות ב-1,000 סל"ד עם אורביטל של 2 מ"מ מספיקה בדרך כלל כדי להשהות מחדש את תאי S288C S. cerevisiae ולמנוע הטיית מדידה.</li>
	<li>העבר את לוחית הדגימה לקורא המיקרו-לוחות באמצעות זרוע הרובוט והסר את המכסה (אם רלוונטי) כדי למנוע הטיה במדידת צפיפות אופטית. תוכנת הבקרה תסיר ותחליף באופן אוטומטי את המכסה למיקום המיועד אם הגדרת הנשא של קורא המיקרו-לוחות מוגדרת כלא לאפשר מכסים.</li>
	<li>הפעל את סקריפט המדידה של קורא לוחות המיקרו כמתואר בשלב 4.</li>
	<li>החלף את המכסה בלוח הדגימה והזז את הצלחת להתקן התאורה באמצעות זרוע הרובוט.</li>
	<li>הגדר את הסקריפט להמתין עד שהטיימר יגיע למרווח הזמן שצוין (לדוגמה, 30 דקות כפול משתנה ספירת הלולאה) ולאחר מכן חזור על הלולאה כולה עבור מספר האיטרציות הרצוי (לדוגמה, 48 פעמים עבור ניסוי של 24 שעות).</li>
	<li>פתור בעיות של שגיאות פוטנציאליות וודא את התפקוד התקין של הגדרות המוביל וכלי המעבדה, כמו גם את היכולת של ה- RGB להרים ולמקם את הצלחת במדויק על ידי הפעלת צלחת ריקה דרך לולאת הסקריפט מספר פעמים.</li>
	<li>הגדר התראות משתמש כדי להודיע למשתמש על כל שינוי במצב המכשיר או שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ביצוע הפרוטוקול.</li>
</ol>6. הגדרת צלחת הדגימה
<ol><li>גדלו זני שמרים על צלחות מדיה עשירות, כגון אגר YPD17 (ראו טבלת חומרים). כלול פקד שאינו פלואורסצנטי (שלילי).</li>
	<li>בחרו מושבות מהלוחות וחסנו אותן ל-3 מ"ל של מדיה SC14 (או מדיה פלואורסצנטית נמוכה אחרת, כגון LFM18) בצינורות תרבית זכוכית. יש לדגור על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 30°C על תוף רולר תוך שמירה עליהן בחושך או בתנאי תאורה שאינם מגיבים (למשל, אור אדום עבור מערכות המגיבות לאור כחול).</li>
	<li>מדוד את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה על-ידי דילול 200 μL מכל תרבית ל-1 מ"ל של מדיית SC והקלטת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא מיקרו-לוחות.</li>
	<li>יש לדלל כל תרבית לילה ל-OD600 של 0.1 בצינורות תרבית זכוכית. לבדיקת מאמץ בתפוקה גבוהה יותר, בצעו דילולים אוטומטיים בלוחות מיקרו-באר.</li>
	<li>פיפטה את התרבויות המדוללות לתוך צלחת 96 בארות. כלול בארות משולשות עבור כל מצב (כלומר, שלוש בארות זהות עם אותו זן ומצב קל) כדי לקחת בחשבון את השונות הטכנית. כלול בארות עם מדיה ריקה ותאים שאינם פלואורסצנטיים כבקרות שליליות למדידת פלואורסצנטיות רקע וצפיפות אופטית.</li>
	<li>יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 30°C תוך טלטול במשך 5 שעות לפני תחילת ניסוי השראת האור. התאימו את כמויות הדילול וזמני הדגירה לפי הצורך כדי למטב זנים ספציפיים ותנאי ניסוי.</li>
</ol>7. ביצוע הניסוי
<ol><li>הניחו את צלחת הדגימה על שייקר החימום והפעילו את סקריפט האוטומציה כמתואר בשלב 5.</li>
	<li>התחל את תוכנית גירוי האור כמתואר בשלב 3 לאחר הקלטת המדידה הראשונית בקורא הלוחות.</li>
	<li>אם תחנת העבודה לאוטומציה אינה נמצאת בחדר חשוך, כסו אותה בווילון האפלה כדי למנוע תאורת רקע.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים
<ol><li>צור מפת גיליון אלקטרוני עבור הניסוי, המשקפת את הפריסה של 8 x 12 של לוח 96 בארות. ודא שהמפה כוללת את שמות הזנים הנמדדים ברשת אחת ותיאורים של תנאי האור המשמשים ברשת אחרת.</li>
	<li>השתמש בסקריפט Python או בשפת תכנות מועדפת אחרת כדי לנתח את הנתונים המיוצאים. יבא את הגיליון האלקטרוני של המפה למערך, תוך שיוך שמות הזנים ושמות התנאים לכל באר של הלוח. הערה: ניתן למצוא קוד לדוגמה לניתוח בכתובת: https://github.com/mccleanlab/Lustro. לחילופין, ניתן להשתמש באפליקציה לניתוח נתונים מקוראי לוחות שונים19.</li>
	<li>קרא את הנתונים מהגיליון האלקטרוני של הניסוי המיוצא למערך אחר.</li>
	<li>צור חלקות של ערכי הצפיפות האופטית וערכי הפלואורסצנטיות עבור כל זן ומצב לאורך זמן, כפי שמודגם באיור 4.</li>
	<li>בחן את תרשימי הצפיפות האופטית כדי לקבוע את שלבי הצמיחה או הרוויה המעריכית בתרבויות. מידע זה יסייע בבחירת נקודות זמן מתאימות להשוואת מדידות פלואורסצנטיות בין זנים או תנאים, כפי שמתואר באיור 5.</li>
</ol>

ניתוח תגובה אופטוגנטית של שמרים באמצעות טכניקת האוטומציה של Lustro

<ol>
	<li>P&#233;rez, A. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+strategies+for+the+control+of+gene+expression+in+yeasts.">Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts.</a> Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).</li><li>Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+transcriptional+programming+and+genetic+engineering.">Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering.</a> Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).</li><li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology.">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).</li><li>Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+in+vitro+and+in+vivo+Activities+of+Light+Inducible+Dimers:+a+Cellular+Optogenetics+Guide.">Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).</li><li>Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+signal+generators:+integrating+synthetic+biology+tools+and+in+silico+control.">Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control.</a> Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).</li><li>Harmer, Z. P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lustro:+High-throughput+optogenetic+experiments+enabled+by+automation+and+a+yeast+optogenetic+toolkit.">Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit.</a> ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>H&#246;hener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITOS:+a+versatile+LED+illumination+tool+for+optogenetic+stimulation.">LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation.</a> Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).</li><li>Gr&#248;dem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments.">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li><li>Dunlop, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).</li><li>Thomas, O. S., H&#246;rner, M., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graphical+user+interface+to+design+high-throughput+optogenetic+experiments+with+the+optoPlate-96.">A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96.</a> Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).</li><li>Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light+alters+yeast+metabolic+rhythms+by+inhibiting+respiration.">Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Complete+(SC)+Medium.">Synthetic Complete (SC) Medium.</a> 2016 (11), (2016).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li><li>Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+wavelengths+collide:+bias+in+cell+abundance+measurements+due+to+expressed+fluorescent+proteins.">When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YPD+media.">YPD media.</a> 2010 (9), (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).</li><li>Csibra, E., Stan, G. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parsley:+a+web+app+for+parsing+data+from+plate+readers.">Parsley: a web app for parsing data from plate readers.</a> Zenodo. , (2023).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cybergenetic+control+of+bacterial+co-culture+composition+via+optogenetic+feedback.">Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback.</a> Nature Communications. 13, 4808 (2022).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7, 12546 (2016).</li><li>Bertaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+bioreactor+arrays+for+automated+measurements+and+reactive+control+with+ReacSight.">Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight.</a> Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).</li><li>Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+closed-loop+feedback+control+of+the+unfolded+protein+response+optimizes+protein+production.">Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production.</a> Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).</li><li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures.">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feedback-enabled+optogenetic+stimulation+and+spectroscopy+in+microwell+plates.">High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+beta-carotene+bioproduction+in+yeast+across+multiple+lab-scales.">Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).</li><li>Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול Lustro המוצג כאן הופך את תהליכי הגידול, ההארה והמדידה לאוטומטיים, ומאפשר סינון ואפיון של מערכות אופטוגנטיותבתפוקה גבוהה 6. זה מושג על ידי שילוב התקן תאורה, קורא microplate, ומכשיר טלטול לתוך תחנת עבודה אוטומציה. פרוטוקול זה מדגים באופן ספציפי את התועלת של Lustro לסינון מבנים אופ...

אופטוגנטיקה היא טכניקה רבת עוצמה המשתמשת בחלבונים רגישים לאור כדי לשלוט בהתנהגות התאים בדיוקגבוה 1,2,3. עם זאת, אב טיפוס של מבנים אופטוגנטיים וזיהוי תנאי תאורה אופטימליים יכולים לגזול זמן, מה שמקשה על אופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות 4,5. שיטות בעלות תפוקה גבוהה לסינון ואפיון מהיר של פעילות מערכות אופטוגנטיות יכולות להאיץ את מחזור התכנון-בנייה-בדיקה של מבני אב טיפוס וחקירת תפקודם.
פלטפורמת Lustro פותחה כטכניקת אוטומציה מעבדתית המיועדת לסינון ואפיון מערכות אופטוגנטיות בתפוקה גבוהה. הוא משלב קורא microplate, התקן תאורה ומכשיר רעידות עם תחנת עבודה אוטומציה6. Lustro משלבת תרבית אוטומטית וגירוי אור של תאים בלוחות מיקרו-בארות (איור 1 ואיור משלים 1), ומאפשרת סינון מהיר והשוואה של מערכות אופטוגנטיות שונות. פלטפורמת Lustro ניתנת להתאמה גבוהה וניתן להכליל אותה לעבודה עם רובוטים אחרים לאוטומציה במעבדה, התקני תאורה, קוראי לוחות, סוגי תאים ומערכות אופטוגנטיות, כולל אלה המגיבים לאורכי גל שונים של אור.
פרוטוקול זה מדגים את ההגדרה והשימוש בלוסטרו לאפיון מערכת אופטוגנטית. בקרה אופטוגנטית של גורמי שעתוק מפוצלים בשמרים משמשת כמערכת לדוגמה כדי להמחיש את הפונקציה והתועלת של הפלטפורמה על ידי חקירת הקשר בין קלט אור לבין ביטוי של גן כתב פלואורסצנטי, mScarlet-I7. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לייעל את האופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות ולהאיץ את הגילוי של אסטרטגיות חדשות לבקרה דינמית של מערכות ביולוגיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plate with&#160; #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P96-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioShake 3000-T elm (heater shaker)</td>
			<td>QINSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluent Automation Workstation</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LITOS (alternative illumination device)</td>
			<td>Hohener, et al. Scientific Reports. 2022</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optoPlate-96 (illumination device)</td>
			<td>Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic Gripper Arm</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers &#8211; eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark (plate reader)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete media</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Connect (user alert app)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1734 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1763 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1765 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optogenetics experiments in yeast using the automated platform lustro

אופטוגנטיקה מציעה שליטה מדויקת על התנהגות התא על ידי שימוש בחלבונים רגישים לאור המקודדים גנטית. עם זאת, אופטימיזציה של מערכות אלה כדי להשיג את הפונקציונליות הרצויה דורשת לעתים קרובות מחזורי תכנון-בנייה-בדיקה מרובים, שיכולים לגזול זמן רב ולעבוד הרבה. כדי להתמודד עם אתגר זה, פיתחנו את Lustro, פלטפורמה המשלבת גירוי אור עם אוטומציה במעבדה, ומאפשרת סינון יעיל בתפוקה גבוהה ואפיון של מערכות אופטוגנטיות.
Lustro משתמשת בתחנת עבודה אוטומטית המצוידת במכשיר תאורה, מכשיר טלטול וקורא לוחות. על ידי שימוש בזרוע רובוטית, Lustro הופכת את התנועה של צלחת מיקרו-באר בין התקנים אלה לאוטומטית, ומאפשרת גירוי של זנים אופטוגנטיים ומדידת התגובה שלהם. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לשימוש ב- Lustro לאפיון מערכות אופטוגנטיות לבקרת ביטוי גנים בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מכסה את ההתקנה של רכיבי Lustro, כולל שילוב של התקן התאורה עם תחנת העבודה אוטומציה. הוא גם מספק הוראות מפורטות לתכנות מכשיר התאורה, קורא הלוחות והרובוט, ומבטיח פעולה חלקה ורכישת נתונים לאורך כל תהליך הניסוי.

Optogenetics is a powerful technique that utilizes light-sensitive proteins to control the behavior of cells with high precision1,2,3. However, prototyping optogenetic constructs and identifying optimal illumination conditions can be time-consuming, making it difficult to optimize optogenetic systems4,5. High-throughput methods to rapidly screen and characterize the activity of optogenetic systems can accelerate the design-build-test cycle for prototyping constructs and exploring their function.
The Lustro platform was developed as a laboratory automation technique designed for high-throughput screening and characterization of optogenetic systems. It integrates a microplate reader, illumination device, and shaking device with an automation workstation6. Lustro combines automated culturing and light stimulation of cells in microwell plates (Figure 1 and Supplementary Figure 1), enabling the rapid screening and comparison of different optogenetic systems. The Lustro platform is highly adaptable and can be generalized to work with other laboratory automation robots, illumination devices, plate readers, cell types, and optogenetic systems, including those responsive to different wavelengths of light.
This protocol demonstrates the setup and use of Lustro for characterizing an optogenetic system. Optogenetic control of split transcription factors in yeast is used as an example system to illustrate the function and utility of the platform by probing the relationship between light inputs and the expression of a fluorescent reporter gene, mScarlet-I7. By following this protocol, researchers can streamline the optimization of optogenetic systems and accelerate the discovery of new strategies for the dynamic control of biological systems.

מחבר זרקור: קידום מחקר אופטוגנטיקה באמצעות Lustro 

ניסויים באופטוגנטיקה בתפוקה גבוהה בשמרים באמצעות הפלטפורמה האוטומטית Lustro

Different devices such as bioreactors and microwell plate illuminators are currently available. Bioreactors offer fine temporal resolution but are limited in throughput. Microwell plate devices offer higher throughput, but lack automation for reliable recording of outputs over time.Lustro offers reliable and high throughput characterization of optogenetic systems in real time. It can also interface with assays that can be performed by liqui-handling robots. Optogenetic systems are an attractive tool due to the fine spatial and temporal control they offer over cellular behavior.The ability to design, build, and test optogenetic systems more rapidly will pave the way for better understanding and control of biological behavior.

איור 4A מראה את הערכים הפלואורסצנטיים לאורך זמן עבור זן אופטוגנטי המבטא כתב פלואורסצנטי הנשלט על-ידי גורם שעתוק מפוצל הניתן להשראת אור. תנאי האור השונים המשמשים בניסוי משתקפים על ידי שינויים במחזור העבודה, המייצג את אחוז הזמן שבו האור דולק. רמת הפלואורסצנטיות הכוללת נצפתה ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Optogenetics Research Using Lustro at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשימוש בפלטפורמה האוטומטית Lustro לביצוע אפיון תפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות בשמרים.

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

מכשירים שונים כגון ביוריאקטורים ומאירי לוחות מיקרווול זמינים כיום. ביוריאקטורים מציעים רזולוציה טמפורלית עדינה אך הם מוגבלים בתפוקה. התקני לוחות Microwell מציעים תפוקה גבוהה יותר, אך חסרים אוטומציה לרישום אמין של יציאות לאורך זמן.Lustro מציעה אפיון אמין ובתפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות בזמן אמת. הוא יכול גם להתממשק עם בדיקות שיכולות להתבצע על ידי רובוטים המטפלים בליקווי. מערכות אופטוגנטיות הן כלי אטרקטיבי בשל השליטה המרחבית והזמנית העדינה שהן מציעות על ההתנהגות התאית.היכולת לתכנן, לבנות ולבדוק מערכות אופטוגנטיות במהירות רבה יותר תסלול את הדרך להבנה ובקרה טובות יותר של התנהגות ביולוגית.

high-throughput-optogenetics-experiments-yeast-using-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

508 Views.  University of Wisconsin-Madison. מכשירים שונים כגון ביוריאקטורים ומאירי לוחות מיקרווול זמינים כיום. ביוריאקטורים מציעים רזולוציה טמפורלית עדינה אך הם מוגבלים בתפוקה. התקני לוחות Microwell מציעים תפוקה גבוהה יותר, אך חסרים אוטומציה לרישום אמין של יציאות לאורך זמן.Lustro מציעה אפיון אמין ובתפוקה גבוהה של מער?...

Video: מחבר זרקור: קידום מחקר אופטוגנטיקה באמצעות Lustro 

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

Using Lustro for Automated High-Throughput Optogenetic Characterization of Yeast

Start by setting up the automation workstation. Incorporate a microplate illumination device, such as an optoPlate, that allows convenient robot gripper arm access. Next, process a spreadsheet with the available MATLAB script to program the optoPlate.Execute the light stimulation program by flashing onto the optoPlate. To program the robot, troubleshoot any potential errors to ensure the proper functioning of the carrier and LabWare definitions. Run an empty plate through the script loop multiple times to verify the robot gripper arm's ability to pick up and place the plate accurately.Next, select colonies from the plates to set up the sample plate. Then inoculate them into three milliliters of synthetic complete media in glass culture tubes. Incubate these cultures overnight at 30 degrees Celsius on a roller drum in the dark.In cuvette, dilute 200 microliters of the culture in one milliliter of synthetic complete medium. Record its optical density using a spectrophotometer. Next, dilute each overnight culture to an optical density of 0.1 in glass culture tubes.Pipette the diluted cultures into a 96-well plate. Include wells with blank media and non-fluorescent cells as negative controls. Incubate the sample plate in a shaker incubator at 30 degrees Celsius for five hours.Now, place the sample plate on the heater shaker. Initiate the automation script by clicking on Run. Once the initial measurement has been recorded on the plate reader, start the light stimulation program by switching on the power strip of the illumination device.The fluorescence values over time for an optogenetic strain showed that the overall fluorescence level was proportional to the duty cycle of the light stimulation. The corresponding optical density values were consistent, suggesting that growth remained unaffected by varying light conditions. Different optogenetic strains employed different responses to light pulse intensity, period, and duty cycle variations.