המחברים מבקשים להודות לאלכס וולקרלינג, מרטין אנגל ורייצ'ל אקונומיק על עזרתם בפיתוח הפרוטוקול והמשוב על כתב היד.

תרביות ביולוגיות תלת-ממדיות של נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC

<ol>
	<li>Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+burden+metrics+the+innovations+of+leading+pharmaceutical+companies:+a+global+and+regional+comparative+study.">Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study.</a> Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).</li><li>Potkin, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+treatment-resistant+schizophrenia:+paths+to+antipsychotic+resistance+and+a+roadmap+for+future+research.">The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research.</a> npj Schizophrenia. 6, 1 (2020).</li><li>Zahra, W., et al., Keswani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Economic+Impact+of+Neurodegenerative+Diseases:+Opportunities+and+Challenges.">The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges.</a> Bioeconomy for Sustainable Development. , (2019).</li><li>Perucca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacological+treatment+of+epilepsy:+recent+advances+and+future+perspectives.">The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives.</a> Acta Epileptologica. 3 (1), 22 (2021).</li><li>Nikolakopoulou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+translational+engineered+in+vitro+models+of+the+central+nervous+system.">Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system.</a> Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).</li><li>Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+models+of+neurodegeneration:+implementation+in+drug+discovery.">3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).</li><li>Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+brain+extracellular+matrix+in+vitro:+A+review+of+current+methodologies+and+challenges.">Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges.</a> Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).</li><li>Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+perineuronal+nets+and+the+perinodal+extracellular+matrix+in+neuronal+function.">The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).</li><li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+extracellular+matrix+accelerates+the+formation+of+neural+networks+and+communities+in+a+neuron-glia+co-culture+on+a+multi-electrode+array.">Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array.</a> Scientific Reports. 9, 4159 (2019).</li><li>Roll, L., Lessmann, K., Br&#252;stle, O., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+maintain+the+expression+of+neural+stem+cell-associated+glycoepitopes+and+extracellular+matrix.">Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix.</a> Cells. 11 (5), 760 (2022).</li><li>Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+to+study+extracellular+matrix+development+during+neural+degeneration.">The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration.</a> Cells. 8 (3), 242 (2019).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+hyaluronic+acid-based+cell-laden+scaffold+for+brain+microenvironment+simulation.">3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation.</a> Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).</li><li>Liaw, C. -. Y., Ji, S., Guvendiren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+3D+hydrogels+for+personalized+in+vitro+human+tissue+models.">Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165 (2018).</li><li>Ma, J., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+mechanism+of+three-dimensional+hydrogel+system+in+regulating+stem+cell+fate.">Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).</li><li>Belfiore, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+3D+cell+culture+models+for+drug+discovery.">Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876 (2021).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+high+throughput+drug+discovery+in+3D+cell+cultures+through+a+novel+bioprinting+workflow.">Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow.</a> SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).</li><li>Takamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+age+on+global+and+regional+brain+stiffness+in+young+and+middle-aged+adults.">Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).</li><li>Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+neurodegenerative+diseases.">In vitro models of neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328 (2020).</li><li>de Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+variability+examined.">Organoid variability examined.</a> Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).</li><li>Hern&#225;ndez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+variabilities+of+human+iPSC-derived+cerebral+organoids+are+a+major+issue+for+the+modelling+of+phenotypes+observed+in+Alzheimer's+disease.">Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease.</a> Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+iPS+cells+into+sensory+neurons+exhibits+developmental+stage-specific+cryopreservation+challenges.">Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960 (2021).</li><li>Nishiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+and+efficient+method+for+cryopreservation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+stem+and+progenitor+cells+by+a+programmed+freezer+with+a+magnetic+field.">Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field.</a> Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).</li><li>Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell+recovery:+Freezing+and+thawing+optimization+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells.</a> Cells. 11 (5), 799 (2022).</li><li>Harbom, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+rho+kinase+inhibition+on+morphological+and+electrophysiological+maturity+in+iPSC-derived+neurons.">The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons.</a> Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).</li><li>Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+neurite+outgrowth+using+nano-structured+scaffolds+coupled+with+laminin.">Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin.</a> Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).</li><li>Tarus, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+hyaluronic+acid+hydrogels+to+promote+neurite+outgrowth+in+three+dimensions.">Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).</li><li>Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiative+Cell+Census+Network+(BICCN).+A+multimodal+cell+census+and+atlas+of+the+mammalian+primary+motor+cortex.">Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).</li><li>Dauchy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+transcriptional+regulation+of+ABC+transporters+and+cytochromes+P450+in+hCMEC/D3+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain:+A+review+of+150+years+of+cell+counting.">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+stem+cell-derived+central+nervous+system+cells+enables+astrocyte+growth,+vasculogenesis+and+enhances+neural+differentiation/function.">3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+deterministic+forward+programming+of+human+pluripotent+stem+cells+into+neurons,+skeletal+myocytes,+and+oligodendrocytes.">Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li></ol>

CW, NC ו-JB הם עובדים של Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, לונדון, בריטניה. YH הוא עובד של Merck Sharp & Dohme LLC, חברת בת של Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.
איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com.

הצורך במודלים מדויקים של מערכת העצבים המרכזית מעולם לא היה גבוה יותר, והמגבלות של מודלים דו-ממדיים מסורתיים (2D) של תרביות תאים הניעו דור של מודלים מורכבים של מערכת העצבים המרכזית בשניםהאחרונות 19. עם זאת, מודלים תלת-ממדיים מורכבים רבים המייצגים אינטראקציות בין סוגי תאים עצביים לבין ECM יש מגבלות שימנעו את היישום של מודלים אלה בתהליכים תעשייתיים 6,20,21. בפרוטוקול זה, אנו מפתחים מודל קוקולטורה תלת-ממדית של נוירונים ואסטרוציטים אנושיים שמקורם ב-iPSC, שמטרתו לפתור חלק מהמגבלות הללו באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור פיגום הידרוג'ל ביו-אקטיבי בפורמטים של 96 בארות ו-384 בארות.
המתודולוגיה לפיתוח מודלים אלה פשטה באמצעות תוכנת עיצוב מפת הלוחות, פרוטוקולי הדפסה שנוצרו באופן אוטומטי ותהליך הדפסה מודרך מהמדפסת הביולוגית. עם זאת, בשל האופי הרגיש של סוגי התאים הרגישים שמקורם ב-iPSC המשמשים בפרוטוקול זה, יש לנקוט בזהירות עם השלבים הקריטיים הבאים בהפשרה ובתרבית. ראשית, להכללת מעכב ROCK (ROCKi) יש מספר יתרונות לאורך תהליך ההדפסה הביולוגית ובמהלך התרבות המוקדמת. הפשרת תאים היא נקודה קריטית שבה תאי העצב יכולים לחוות תגובת דחק, ופרוטוקולי הפשרה לא נכונים יכולים להקטין את סיכויי ההישרדות22. בדרך כלל מומלץ להפשיר תאים, להוסיף מדיה ולהעלות את התאים לטמפרטורת האינקובטור בצורה יעילה ככל האפשר23. עם זאת, במהלך תהליך ההדפסה הביולוגית המתואר בפרוטוקול זה, יש צורך שתאי עצב ואסטרוציטים יושהו מחדש בתמיסת אקטיבטור ולא במדיה, ותאים לא יתרוממו מעל טמפרטורת החדר עד סוף ריצת ההדפסה (עד 30 דקות לאחר ההפשרה). לפיכך, הוספת ROCKi למדיה מיד לאחר ההפשרה והכללתה במהלך שני שלבי הצנטריפוגה (שלבים 2.1--2.7 ו-1.3.15-1.3.20) הכרחית כדי לעכב מסלולי לחץ תאי, מה שיביא לרמות כדאיות נמוכות יותר24. יתר על כן, הוכח כי ROCKi מקדם צמיחה של נוירוטים ומשפר את ההתבגרות העצבית25. לפיכך, תוספת ROCKi נמשכת במשך 48 שעות לאחר הדפסה ביולוגית. עם זאת, זה הכרחי להסיר תוספת ROCKi לאחר 48 שעות כדי להבטיח שטיפה מלאה במהלך שינויי המדיה הבאים לפני התאים משמשים לבדיקה.
צעד נוסף הדורש תשומת לב קריטית הוא במהלך הוספת מדיה לאחר הדפסה ושינויים במדיה (שלבים 2.8-2.13). פיגום ההידרוג'ל המודפס ביולוגית הוא בעל קשיחות ביומכנית שוות ערך של 1.1 kPa בלבד, שווה ערך לחומר אפור. כפי שמתואר בשלב 2.10, קריטי לחדור בעדינות לצד הבאר במהלך חיבור המדיה ושאיפה למניעת הפרעה. זה רלוונטי במיוחד לצלחות 384 באר, שם רמת הג'ל תופסת שיעור גבוה יותר מנפח הבאר הכולל. שיטה זו צריכה לשמש גם בארות בקרה דו-ממדיות כדי למנוע הרמת קצה של תאים וגזירה של גידולי עצבים. המחברים רוצים גם להדגיש את החשיבות של טכניקה סטרילית בתוך המדפסת הביולוגית, אשר יש להתייחס אליה בזהירות שווה לזו של ארון בטיחות ביולוגית המשמש לתרביות תאים שמקורם ב- iPSC. זה כולל סינון סטרילי 70% EtOH ו-dH2O המשמש בתהליכי התאורה הירוקה וההדפסה, שמירה על מכסים על המחסניות והלוחות בעת העברת ידיים פנימה והחוצה מהמדפסת הביולוגית, וחיטוי משטחים בתוך המדפסת הביולוגית עם מגבוני אתנול 70% לפני ואחרי ההדפסה.
פיגום ההידרוג'ל המודפס ביולוגית, הנוצר מפתרונות ביו-דיו ואקטיבטור, שנבחר לפיתוח מודל זה, נבחר מתוך מגוון פתרונות ביו-דיו ואקטיבטור שפותחו על ידי Inventia Life Science לשימוש במדפסת הביולוגית RASטרום. למינין וחומצה היאלורונית זוהו כמולקולות רלוונטיות להבשלה עצבית הנגזרת מ- iPSC בשל תפקידן בהנחיה אקסונלית, היווצרות סינפסות ויצירת הרשת הפרינוירונלית26,27. יתר על כן, נבחרה קשיחות ביומכנית של 1.1 kPa, שכן הידרוג'לים בצפיפות נמוכה יותר הוכחו כמאפשרים צמיחה טובה יותר של נוירונים12. אם נעשים שינויים בפרוטוקול באמצעות נוירונים ואסטרוציטים שהובחנו בתוך החברה או מספק מסחרי אחר, מומלץ לבצע בדיקת בחירת מטריצה כדי לקבוע את פיגום ההידרוג'להתומך ביותר 15. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות התאים אם נעשים שינויים במקורות התא כדי להבטיח כדאיות אופטימלית ולמנוע צפיפות הידרוג'ל. עבור כל השינויים ופתרון הבעיות הקשורים לפונקציית המדפסת הביולוגית, המחברים ממליצים לפנות ליצרנים ולהפנות לפרוטוקולי יצרן.
מערכת העצבים המרכזית מכילה מגוון רחב של תת-סוגים עצביים ותאי גלייה, שכולם קיימים בגומחות מוח שונות ויש להם תפקידים ספציפיים התורמים לתפקוד העצבי28. בהקשר של טווח רחב זה, מודל זה מייצג רק את שני סוגי התאים הנפוצים ביותר (אסטרוציטים ונוירונים גלוטמטרגיים מעוררים). סוגי תאים חשובים כגון מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים ותאי אנדותל יוצרי מחסום דם-מוח מושמטים ממערכת זו. הכללת מיקרוגליה יכולה להיות רלוונטית בהתמקדות באינטראקציות נוירואימוניות, ואוליגודנדרוציטים יכולים להיות בעלי עניין במחלות המשפיעות על מיאלינציה מרכזית. בנוסף לתפקידם בפתולוגיה, תאים כגון תאי אנדותל יוצרי מחסום דם-מוח מפרישים אנזימים לחילוף חומרים של תרופות, מה שעשוי להשפיע על השימוש במודל זה לבדיקות פרמקוקינטיות29. מגבלה נוספת של המודל עשויה להיות היחס בין אסטרוציטים לנוירונים; היחס בין אסטרוציטים לנוירונים משתנה מאוד בין אזורי המוח, עם ערכים מוצעים של בין 1:1 ל-1:330,31. מודל זה יש יחס משוער של 1:1.5 אסטרוציטים לנוירונים; לכן, ייתכן שהמודל הזה לא יהיה רלוונטי למודלים של אזורים במוח שבהם אסטרוציטים נפוצים יותר, כמו למשל באזורי החומר הלבן30.
פרוטוקולים אחרים לפיתוח מודלים של חקלאות ביולוגית מודפסת בתלת ממד פורסמו בשנים האחרונות. פרסום של Sullivan et al., 2021, הציג מודל עצבי מודפס ביולוגית תלת-ממדית באמצעות תאי אב עצביים שמקורם ב-iPSC, אשר מדגים כדאיות גבוהה לאחר הדפסה ושיפור התפקוד העצבי בהשוואה לתרביות דו-ממדיות32. עם זאת, בפרוטוקול זה, תאי אב עצביים שימשו כמקור תא ונשמרו בתרבית במשך 4 שבועות. בפרוטוקול זה נעשה שימוש מסחרי בנוירונים גלוטמטרגיים ובאסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. זה מאפשר רשת תלת ממדית של תאים בתרבית משותפת כדי לקום בתוך 7 ימים בלבד; כפי שהודגם על ידי ניתוח צמיחת נוירוטים, צמיחת נוירויט מתחילה תוך 24 שעות וממשיכה באופן ליניארי לאורך 156 השעות שעבורן נוטרה צמיחת תאים. את ההקמה המהירה של רשתות אלה ניתן לייחס בחלקה לשימוש בנוירונים גלוטמטרגיים המשתמשים בביטוי גנים אופטימלי של NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין, אשר מראה ביטוי של סמנים תת-עצביים בוגרים בתוך 7 ימים, אפילו בתרבית דו-ממדית33. קיצור תקופת צמיחה זו באמצעות טכניקה זו חשוב ליישום מודלים בתעשיית הביו-פרמצבטיקה, שכן פיתוח בדיקות דורש תפנית ופיתוח מהירים של מודלים תאיים15.
לסיכום, מודל זה מראה פוטנציאל למודל תלת ממדי של נוירונים ואסטרוציטים, אשר נקבע במהירות ובנוחות למטרות סינון. יישומים עתידיים עבור סוג מודל זה יכולים להיות עבור מאמצי גילוי תרופות על פני מחלות CNS שונות, עם הזדמנות להתרחב למחלות שונות באמצעות חולים או מחלות ערוכות גנטית iPSC. יתר על כן, השימוש בתאי עצב גלוטמטרגיים המופקים מ-iPSC בביטוי NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין מאפשר לתאים להגיע לבגרות בפחות זמן, אשר ניתן לנצל לפיתוח מודלים של המוח המזדקן לחקר ניוון עצבי. מערכת זו יכולה להתרחב גם באמצעות שימוש בסוגי תאים נוספים בחקלאות משותפת, כולל מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated from:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD R&#38;D Innovation Centre Ltd 
2Merck &#38; Co., Inc.
to:
Chloe Ann Whitehouse1 
Yufang He2 
Janet Brownlees1 
Nicola Corbett1 
1MSD Research Laboratories, London, UK 
2Merck &#38; Co., Inc., Rahway, NJ, USA

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65856">Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

המחקר על מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) בתעשיית גילוי התרופות מתרחב1. עם זאת, מחלות CNS נפוצות רבות כגון אפילפסיה, סכיזופרניה ואלצהיימר עדיין אין טיפולים מרפאים 2,3,4. היעדר טיפולים יעילים במחלות CNS יכול, לפחות בחלקו, להיות מיוחס לחוסר מודלים מדויקים במבחנה של המוח5. זה הביא לפער תרגומי בין מודלים נוכחיים במבחנה לבין נתוני in vivo וצוואר בקבוק עוקב במאמצי המחקר.
מונע על ידי פער תרגומי זה, חלה עלייה משמעותית בפיתוח מודלים חדשניים של תאים תלת-ממדיים בשנים האחרונות, כולל אורגנואידים עצביים, נוירוספרואידים ומודלים מבוססי פיגומים6. המבנה התלת-ממדי של מודלים אלה מסייע בשחזור המיקרו-סביבה העצבית, כולל לחצים ביומכניים, מגעים בין תאים ומטריצה חוץ-תאית במוח (ECM)7. ECM המוח הוא אלמנט דינמי של נוירופיזיולוגיה התופס את החלל בין סוגי תאים עצביים, כולל נוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, והיחידה הנוירו-וסקולרית7. רקפיטולציה של המוח ECM הוכחה כמשפיעה על מורפולוגיה עצבית וירי עצבי, ומודלים תלת-ממדיים מורכבים רבים של המוח הדגימו שקיעת חלבוני ECM על ידי סוגי תאים עצביים 8,9,10,11. מודלים מבוססי פיגומים מורכבים מתרבויות עצביות בוגרות המרחפות במטריצת הידרוג'ל סינתטית או ביולוגית נקבובית המייצגת את המוח ECM12. שלא כמו מערכות אורגנואידים וכדורואידים, מודלים תלת-ממדיים מבוססי פיגומים מאפשרים התאמה אישית של חלבוני ECM הקיימים ויש להם יתרון נוסף של כוונון קשיחות הידרוג'ל כדי לחקות לחצים ביומכניים13,14.
למרות שרוב מכריע של מודלים עצביים תלת-ממדיים מדגימים שחזור מוגבר של מיקרו-סביבה במוח, לא כל המודלים מתאימים היטב ליישום יישומי גילוי תרופות15. כדי שמודל תלת ממדי יוטמע בתהליכים תעשייתיים, המערכת חייבת לעמוד בדרישות התפוקה לסינון יישומים ולהיות בעלת זמן פיתוח קצר יחסית16. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא טכנולוגיה חדשנית המציעה פוטנציאל ליצירת מודלים עצביים מבוססי פיגומים תלת-ממדיים עם זמן פיתוח מהיר, תפוקה מוגברת ורמות גבוהות יותר של בקרה מדויקת, לצד הסרת השונות הנגרמת כתוצאה מטעויות אנוש17. פרוטוקול זה מציג מודל קו-קולטורה תלת-ממדי של נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים אנושיים שמקורם ב-iPSC בפיגום הידרוג'ל. פיגום הידרוג'ל זה מכיל פפטידים ביו-אקטיביים מייצגים פיזיולוגית (RGD, IKVAV, YIGSR) וחלבוני ECM בתוך קשיחות ביומכנית מימטית. חלבוני ECM באורך מלא אלה כוללים למינין-211 באורך מלא וחומצה היאלורונית, המצויים בשפע בקליפת המוח האנושית, עם קשיחות של 1.1 kPa בהתאם למדידות in vivo 18. מודל זה מתוכנן באופן מעשי לגילוי תרופות, ונוצר באמצעות מדפסת ביולוגית תלת-ממדית בפורמט צלחת של 96 בארות או 384 בארות המתאים לניתוח סינון באמצעות טכניקות הדמיה עם צבעי תאים ונוגדנים, לצד מבחני צמיחה של נוירוטים. תאים מראים ביטוי של סמנים מסוג תא עצבי וצמיחה של תחזיות נוירוריט ואסטרוציטים תוך 7 ימים מהתרבית. לפיכך, פרוטוקול זה יציג את המתודולוגיה לפיתוח מודל קוקולטורה עצבית תלת-ממדית בתפוקה גבוהה לשימוש ביישומי גילוי תרופות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית להמחשה של מתודולוגיה המשמשת להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תרבויות משותפות. תאי עצב ואסטרוציטים אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים משולבים עם תמיסות אקטיבטור וביודיו המכילות פפטידים ביו-אקטיביים ומודפסים ביולוגית על פיגומי הידרוג'ל בפורמטים של 96 בארות או 384 בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית לפי דרישה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6055300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activator fluid F299</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activator fluid F3</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50x) minus Vit A</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink fluid F261</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioink fluid F32</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG H&#38;L Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG H&#38;L Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NT3 Recombinant Protein</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>PHC7036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Astrocytes</td>
			<td>Fujifilm CDI</td>
			<td>1434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCell Analyser 6500HS</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>high content imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3</td>
			<td>Sartorius&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ioGlutamatergic Neurons (Large vial)</td>
			<td>Bit.bio</td>
			<td>e001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead kit (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BIII tubulin NL637 conjugated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>SC024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live (Hoechst 33342)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI 50% in H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>181978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Borate Buffer 20x</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-ionotropic glutamatre receptor 2 (GluR2)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab206293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Bioprinter</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioprinter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Bioprinter Cartridges</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioprinter Cartridges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RASTRUM(TM) Targeting plate</td>
			<td>Inventia Life Science</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Targeting plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase (ROCK) inhibitor</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-GFAP NL493 conjugated</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>SC024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signals Image Artist&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted microscope platform&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional bioprinting of human ipsc-derived neuron-astrocyte cocultures for screening applications

כדי שמודל תאי יהיה בר-קיימא לבדיקת תרופות, המערכת חייבת לעמוד בדרישות התפוקה וההומוגניות לצד זמן פיתוח יעיל. עם זאת, מודלים תלת-ממדיים רבים שפורסמו אינם עומדים בקריטריונים אלה. לכן, זה מגביל את התועלת שלהם ביישומים מוקדמים לגילוי תרופות. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (3D) היא טכנולוגיה חדשנית שניתן ליישם בפיתוח מודלים תלת-ממדיים כדי לזרז את זמן הפיתוח, להגדיל את הסטנדרטיזציה ולהגדיל את התפוקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים תלת-ממדיים של חקלאות משותפת מודפסת ביולוגית של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי גזע גלוטמטרגיים ואסטרוציטים. תרבויות קו-תאיות אלה מוטמעות בתוך מטריצת הידרוג'ל של פפטידים ביו-אקטיביים, חלבוני מטריצה חוץ-תאית באורך מלא (ECM), ועם קשיחות פיזיולוגית של 1.1 kPa. ניתן לבסס את המודל במהירות בפורמטים של 96 בארות ו-384 בארות והוא מייצר כדאיות ממוצעת לאחר הדפסה של 72%. יחס אסטרוציטים לנוירונים במודל זה מוצג כ-1:1.5, הנמצא בטווח הפיזיולוגי של המוח האנושי. אוכלוסיות תאים אלה המודפסות ביולוגית בתלת-ממד מראות גם ביטוי של סמנים בוגרים מסוג תאים עצביים וצמיחה של תחזיות נוירוריט ואסטרוציטים תוך 7 ימים מהתרבית. כתוצאה מכך, מודל זה מתאים לניתוח באמצעות צבעי תאים וטכניקות אימונוסטיין לצד בדיקות צמיחת עצבים. היכולת לייצר מודלים פיזיולוגיים מייצגים אלה בקנה מידה גדול הופכת אותם לאידיאליים לשימוש במבחני סינון בתפוקה בינונית עד גבוהה עבור מטרות במדעי המוח.

Research into central nervous system (CNS) diseases in the drug discovery industry is expanding1. However, many prevalent CNS diseases such as epilepsy, schizophrenia, and Alzheimer&#39;s disease still have no curative treatments2,3,4. The lack of effective therapeutics across CNS diseases can, at least in part, be attributed to a lack of accurate in vitro models of the brain5. This has resulted in a translational gap between current in vitro models and in vivo data and a subsequent bottleneck in research efforts.
Driven by this translational gap, there has been a significant increase in the development of novel 3D cell models within recent years, including neural organoids, neurospheroids, and scaffold-based models6. The 3D structure of these models aids in recapitulating the neural microenvironment, including biomechanical stresses, cell-cell contacts, and the brain extracellular matrix (ECM)7. The brain ECM is a dynamic element of neurophysiology that occupies the space between neural cell types, including neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and the neurovascular unit7. Recapitulation of the brain ECM has been shown to affect neuronal morphology and neuronal firing, and many complex 3D models of the brain have demonstrated deposition of ECM proteins by neural cell types8,9,10,11. Scaffold-based models consist of mature neural cocultures suspended in a porous synthetic or biological hydrogel matrix which represents the brain ECM12. Unlike organoid and spheroid systems, scaffold-based 3D models allow the customization of ECM proteins present and have the added benefit of tunability of hydrogel stiffness to mimic biomechanical stresses13,14.
Although an overwhelming majority of 3D neural models demonstrate an increased recapitulation of the brain microenvironment, not all models are well suited for implementing drug discovery applications15. For a 3D model to be implemented into industrial processes, the system must meet throughput requirements for screening applications and have a relatively short development time16. 3D Bioprinting is a novel technology that offers the potential to create 3D scaffold-based neural models with rapid development time, increased throughput, and higher levels of precision control, alongside the removal of variability caused by human error17. This protocol presents a 3D coculture model of human iPSC-derived glutamatergic neurons and astrocytes in a hydrogel scaffold. This hydrogel scaffold contains physiologically representative bioactive peptides (RGD, IKVAV, YIGSR) and ECM proteins within a mimetic biomechanical stiffness. These full-length ECM proteins include full-length laminin-211 and hyaluronic acid, abundant in the human cortex, with a stiffness of 1.1 kPa in line with in vivo measurements18. This model is designed with practicality for drug discovery, and is&#160;created using a 3D bioprinter in a 96-well or 384-well plate format suitable for screening analysis using imaging techniques with cell dyes and antibodies, alongside neurite outgrowth assays. Cells show expression of neural cell type markers and growth of neurite and astrocytic projections within 7 days of culture. Thus, this protocol will present the methodology to develop a high-throughput 3D neural coculture model for use in drug discovery applications.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig01.jpg" /> 
Figure 1: Illustrative overview of methodology used to 3D bioprint cocultures. Human iPSC-derived neurons and astrocytes are combined with activator and bioink solutions containing bioactive peptides and are bioprinted to hydrogel scaffolds in 96-well or 384-well formats using drop-on-demand bioprinting technology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

מחבר Spotlight: Advanceancing 3D Cell Modeling – גישה בעלת תפוקה גבוהה עבור תרבויות קו-תרבותיות עצביות 

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תרביות נוירון-אסטרוציטים אנושיות שמקורן ב-iPSC עבור יישומי סינון

3D cell modeling is a novel field that has exponentially expanded in the past decade. These models have been shown to both facilitate neuronal growth and more accurately represent disease phenotypes. However, we believe there is a shift towards making these models higher throughput and a necessity to embrace automation within development.Traditional methods of developing 3D cultures can be laborious and time-consuming to establish, but 3D bioprinting is a technology that can be applied to scale up these development processes. This technology allows for hundreds of identical models to be created efficiently and without human error. This protocol develops complex cultures because the neural cells are grown in 3D in biologically active hydrogel matrices.But critically, this protocol prioritizes speed and convenience in model development, which can be lacking in this field and can hinder the implementation into industry. This protocol defines a method to establish many 3D cocultures very efficiently with limited input from users. We hope this will remove barriers to using complex cell culture models within high throughput assays and facilitate further investigation of the effect of 3D culture on neural cell types.

ניתוח גדילה של נוירויט בפרוטוקול זה, נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים שמקורם ב-iPSC הודפסו ביולוגית בחקלאות משותפת למטריצת הידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית התלת-ממדית. במהלך 7 הימים הראשונים לאחר ההדפסה, תאים צולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים. לאחר הדפסה ביולוגית, תאים צריכים להיות בעלי מורפולוגיה מעוגלת ויש לפזר אותם ברחבי מטריצת ההידרוג'ל, תוך שינוי הדרגתי ליצירת צבירי תאים קטנים יותר עם מעט בליטות במהלך הימים הראשונים של התרבית (ראה סרטון משלים 1 לצמיחת תאים בריאה מייצגת). ביום הרביעי, תאים בריאים ינדדו לאורך הג'ל ויצרו אשכולות גדולים יותר, המחוברים דרך גידולי עצבים. ביום ה-7 כמעט ולא אמורים להישאר תאים בודדים, הצרורות המחוברים של תאי עצב ותחזיות אסטרוציטיות אמורים להיראות מבוצרים, וניתן לראות הרבה גידולים קטנים יותר של תאי עצב נוצרים מהצבירים (איור 2A). באמצעות סדרה של תמונות שדה בהיר של תאים חיים שצולמו במהלך תקופת הגדילה בת 7 הימים, בוצע ניתוח של צמיחת נוירוטים כמפורט בסעיף 3. ניתוח זה הראה כי צמיחת תאי עצב גדלה באופן ליניארי כמעט (ערך R2 = 0.84) בין 12 שעות ל-156 שעות (איור 2B). במהלך תקופה זו של צמיחת נוירוטים, אשכולות גוף התא גדלים גם הם (ראה סרטון משלים 1), מה שמעיד על נדידת תאים לאורך ההידרוג'ל.
כדאיות התא ויחס האוכלוסייה בפרוטוקול זה, ריכוז של 20 מיליון תאים/מ"ל, הכולל 15 מיליון נוירונים/מ"ל ו-5 מיליון אסטרוציטים/מ"ל, משמש להדפסה ביולוגית של מודלי התא. באמצעות צביעת תאים חיים עם calcein-AM (תאים חיים), ethidium homodimer-1 (תאים מתים) וכתם גרעיני, ניתן לחשב את מספר התאים ששרדו במשך תקופה של 7 ימים לפי סעיף 4 (איור 3A). תוצאות כדאיות התא עבור תרביות מייצגות מוצגות ליום 4, שבו 72% ±-1% (ממוצע ± SEM) מכלל התאים חיים ומראים צביעה עבור Calcein-AM, בעוד ש-29% ±-2% (ממוצע ± SEM) בסך הכל תאים מתים ומראים צביעה עם אתידיום הומודימר-1 (איור 3B). תמונות מייצגות של צביעת תאים עם Calcein-AM ו-ethidium homodimer-1 ניתן לראות באיור משלים 1. יש לציין כי לא ניתן להשוות ישירות את ערכי הישרדות התאים של תרביות תלת ממדיות לתרביות דו-ממדיות, שכן תאים מתים נשמרים בהידרוג'ל ולא יוסרו במהלך תהליכי הזנת תאים.
באמצעות הצביעה האימונופלואורסצנטית עבור Β-III tubulin ו-GFAP, כפי שמתואר בסעיף 5 ובאיור 4, ניתן לבצע ניתוח תמונה כדי לקבוע את יחסי אוכלוסיית התאים בין תאי עצב לאסטרוציטים (איור 3A). מתוך סך התאים למודל בתרביות מייצגות, נוירונים חיוביים של Β-III טובולין מייצגים 49% ± 3% (ממוצע ± SEM), בעוד אסטרוציטים חיוביים GFAP מייצגים 30% ± 4% (ממוצע ± SEM). זה נותן יחס של 1:1.5, אסטרוציטים לנוירונים, בהתאמה. פעולה זו משאירה שארית של 21% בסך התאים לכל דגם, שאינם מכתימים אף אחד מסמני התא. מכיוון שניתוח כדאיות התא הראה כי ערך ממוצע של 29% מהתאים אינו בר קיימא ביום 4, סביר להניח כי תאים אלה מתים בתוך ההידרוג'ל.
ביטוי סמני תא המורפולוגיה של תאי העצב והאסטרוציטים המודפסים ביולוגית הוערכה באמצעות צביעה חיסונית עבור סמן מסוג תא עצבי (Β-III tubulin) וסמן אסטרוציטי (GFAP). בתרביות המייצגות המוצגות, צביעת מערכת החיסון ממוקמת לסוגי תאים בודדים, ומראה מורפולוגיה בריאה של התא, כאשר שני סוגי התאים מציגים צמיחה של בליטות תאיות (איור 4A,B). מאחר שמבני ההידרוג'ל והתא הם תלת-ממדיים, כל תמונה מייצגת רק פרוסה אחת דרך המבנה באיור 4A,B. איור 4C מראה ערימה ממוזגת של תמונות ברחבי ההידרוג'ל, המדגימות תצוגות של לוקליזציה של תאים במישורי X, Y ו-Z. איור 4D מראה צביעה חיסונית עבור טובולין Β-III בלבד; הדגשת גידולי עצבים עדינים יותר מצברי גוף התא. כדי לבחון עוד יותר את הפנוטיפ של הנוירונים הגלוטמטרגיים, ניתן לבצע צביעה חיסונית עבור סמן הקולטן היוני הגלוטמטרגי, GluR2. בתוך איור 4E, אזור 4E.1 (כניסה) הודגש כדי להראות צביעת ניקוב ברזולוציה גבוהה יותר לאורך צרורות הנוריט. לכן, זה מאשר כי נוירונים ב coculture זה יש פנוטיפ גלוטמטרגי. בכל התמונות של צביעת מערכת החיסון, ניתן לראות מבנים לא-תאיים מוכתמים אימונופלואורסצנטיים סביב צבירי התאים ותאי העצב. סביר להניח כי מבנים אלה מייצגים פסולת הנשמרת בתוך ההידרוג'ל בשילוב עם כמויות קטנות של נוגדנים לא ספציפיים הנקשרים להידרוג'ל. זה צפוי בתרביות מודפסות ביולוגיות, שכן במודלים של פיגומים תלת-ממדיים, תאים מתים ופסולת אינם מוסרים במהלך הזנת תאים. תמונה מייצגת של בקרה שלילית של אימונוסטיין מוצגת באיור משלים 2 להדגמה של קשירה לא ספציפית של נוגדנים משניים באמצעות הידרוג'ל.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig02.jpg"> איור 2: תאי עצב ואסטרוציטים גלוטמטרגיים הודפסו ביולוגית לתוך מטריצת ההידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית וצולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. (A) תמונת שדה בהיר לדוגמה שצולמה של תרביות תאים במהלך ניתוח. התמונה מייצגת נקודת זמן של 156 שעות, וסרגל קנה המידה מייצג 400 מיקרומטר. (B) האורך הממוצע של גידולי נוירונים (μm) מהתרביות שנמדדו באמצעות חבילת NeuronJ עבור ImageJ. כל נקודת נתונים היא n = 3 נוירונים, והנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig03v2.jpg"> איור 3: ריכוז של 20 מיליון תאים/מ"ל של תמיסת אקטיבטור שימש להדפסה ביולוגית של מודלים של תאים. (A) כדאיות התא חושבה באמצעות צבעי תאים חיים/מתים (Calcein-AM ו-ethidium homodimer-1, בהתאמה). הערכים מראים כי 72% ± 1% (ממוצע ± SEM, n = 3) מכלל התאים לבאר הם חיים ו- 29% ± 2% (ממוצע ± SEM, n = 3) מהתאים מתים מכלל אוכלוסיית התאים לבאר ביום 4. הערכים המוצגים מייצגים ממוצע ± SEM. (B) אחוז אוכלוסיות התאים של תאי עצב ואסטרוציטים לבאר חושבו באמצעות ניתוח תמונה של צביעה המוצגת באיור 4. תאי עצב מייצגים את אחוז התאים שהוכתמו חיוביים לטובולין Β-III ביום 7 (49% ± 3%, ממוצע ± SEM, n = 3), בעוד שאסטרוציטים מייצגים את אחוז התאים שהוכתמו חיוביים ל-GFAP ביום 7 (30% ±-4%, ממוצע ± SEM, n = 3). הערכים המוצגים מייצגים ממוצע ± SEM. כל ההדמיה לחישובים המוצגים באיור 3 בוצעה על מערכת הדמיה קונפוקלית, וכל הניתוחים בוצעו על פלטפורמת ניתוח התמונה ועל GraphPad Prism בהתאם לשיטות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65856/65856fig04.jpg"> איור 4: ביטוי של סמנים מסוג תא עצבי בתרביות תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית של נוירונים גלוטמטרגיים ואסטרוציטים ביום 7 . (A,B) צביעה אימונופלואורסצנטית של הסמן העצבי Β-III טובולין וסמן אסטרוציטים GFAP, שצולם על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (C) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן עצבי β-III טובולין וסמן אסטרוציטים GFAP מוכתם יחד עם Hoechst, מוצג בתצוגת מישור XYZ, מצולם על מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10. נוצר בפלטפורמת ניתוח התמונות. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (D) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן עצבי β-III טובולין מוכתם יחד עם Hoechst, בתמונה על מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 20. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (E) צביעה אימונופלואורסצנטית של סמן גלוטמטרגי GluR2 מוכתם יחד עם Hoechst, מצולם על פלטפורמת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10. תיבה 3E.1 מציגה אזורים מודגשים של צביעת GluR2. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/65856fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרטון משלים 1: נוירונים ואסטרוציטים גלוטמטרגיים הודפסו ביולוגית לתוך מטריצת ההידרוג'ל באמצעות המדפסת הביולוגית וצולמו כל 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. וידאו של תמונות שדה בהיר שצולמו של תרביות תאים במהלך ניתוח, נקודות זמן מסומנות בפינה הימנית התחתונה, וסרגלי קנה מידה מייצגים 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 1: תמונות לדוגמה של ניתוח חי/מת של תאי עצב ואסטרוציטים מודפסים ביולוגית ביום 4. כתם Calcein-AM מוצג בירוק (488 ננומטר), וכתם אתידיום הומודימר מוצג באדום (647 ננומטר). התמונה מוצגת בתצוגת מישור XYZ, שנוצרה בפלטפורמת ניתוח התמונה . סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (A) ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 4. (ב) ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 2: דוגמה לתמונת בקרה שלילית לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית. נוגדנים ראשוניים הושמטו, ונוגדנים משניים ירוקים (488 ננומטר) ואדומים (647 ננומטר) שימשו בהתאם לפרוטוקולים של צביעת מערכת החיסון. התמונה מוצגת בתצוגת מישור XYZ, שנוצרה בפלטפורמת ניתוח התמונות. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. ההדמיה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית בהגדלה של פי 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65856/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing 3D Cell Modeling – A High-Throughput Approach for Neural Cocultures at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור תרביות משולבות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית של נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC. מודל קוקולטורה זה, שנוצר בתוך פיגום הידרוג'ל בפורמטים של 96 או 384 בארות, מדגים כדאיות גבוהה לאחר ההדפסה וצמיחת עצבים תוך 7 ימים ומראה את הביטוי של סמני בשלות עבור שני סוגי התאים.

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development ...

מידול תאים תלת ממדי הוא תחום חדשני שהתרחב באופן אקספוננציאלי בעשור האחרון. מודלים אלה הוכחו הן להקל על צמיחה עצבית ובאופן מדויק יותר לייצג פנוטיפים של מחלות. עם זאת, אנו מאמינים שיש שינוי לכיוון הפיכת מודלים אלה לתפוקה גבוהה יותר וצורך לאמץ אוטומציה בתוך הפיתוח.שיטות מסורתיות לפיתוח תרבויות תלת-ממדיות יכולות להיות מייגעות וגוזלות זמן להקמה, אך הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא טכנולוגיה שניתן ליישם כדי להרחיב את תהליכי הפיתוח הללו. טכנולוגיה זו מאפשרת ליצור מאות דגמים זהים ביעילות וללא טעויות אנוש. פרוטוקול זה מפתח תרביות מורכבות מכיוון שהתאים העצביים גדלים בתלת-ממד במטריצות הידרוג'ל פעילות ביולוגית.אבל באופן קריטי, פרוטוקול זה מתעדף מהירות ונוחות בפיתוח מודלים, אשר יכול להיות חסר בתחום זה יכול לעכב את היישום לתוך התעשייה. פרוטוקול זה מגדיר שיטה להקים תרבויות תלת-ממדיות רבות ביעילות רבה עם קלט מוגבל מהמשתמשים. אנו מקווים שזה יסיר מחסומים לשימוש במודלים מורכבים של תרביות תאים במבחני תפוקה גבוהה ויקל על חקירה נוספת של ההשפעה של תרבית תלת-ממדית על סוגי תאים עצביים.

three-dimensional-bioprinting-human-ipsc-derived-neuron-astrocyte

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications

3.3K Views.  MSD Research Laboratories, London, UK. מידול תאים תלת ממדי הוא תחום חדשני שהתרחב באופן אקספוננציאלי בעשור האחרון. מודלים אלה הוכחו הן להקל על צמיחה עצבית ובאופן מדויק יותר לייצג פנוטיפים של מחלות. עם זאת, אנו מאמינים שיש שינוי לכיוון הפיכת מודלים אלה לתפוקה גבוהה יותר וצורך לאמץ אוטומציה בתוך הפיתוח.שיטות מ?...

Video: מחבר Spotlight: Advanceancing 3D Cell Modeling – גישה בעלת תפוקה גבוהה עבור תרבויות קו-תרבותיות עצביות 

For a cell model to be viable for drug screening, the system must meet throughput and homogeneity requirements alongside having an efficient development time. However, many published 3D models&#160;do not satisfy these criteria. This therefore, limits their usefulness in early drug discovery applications. Three-dimensional (3D) bioprinting is a novel technology that can be applied to the development of 3D models to expedite development time, increase standardization, and increase throughput. Here, we present a protocol to develop 3D bioprinted coculture models of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived glutamatergic neurons and astrocytes. These cocultures are embedded within a hydrogel matrix of bioactive peptides, full-length extracellular matrix (ECM) proteins, and with a physiological stiffness of 1.1 kPa. The model can be rapidly established in 96-well and 384-well formats and produces an average post-print viability of 72%. The astrocyte-to-neuron ratio in this model is shown to be 1:1.5, which is within the physiological range for the human brain. These 3D bioprinted cell populations also show expression of mature neural cell type markers and growth of neurite and astrocyte projections within 7 days of culture. As a result, this model is suitable for analysis using cell dyes and immunostaining techniques alongside neurite outgrowth assays. The ability to produce these physiologically representative models at scale makes them ideal for use in medium-to-high throughput screening assays for neuroscience targets.

Here, we present a protocol to produce 3D-bioprinted cocultures of iPSC-derived neurons and astrocytes. This coculture model, generated within a hydrogel scaffold in 96- or 384-well formats, demonstrates high post-print viability and neurite outgrowth within 7 days and shows the expression of maturity markers for both cell types.

Generating Plate Map and Coating of 2D Control on Plastic Wells for 3D Bioprinting of Human iPSC-Derived Cells

To begin open the plate map software and select the culture cells in the 3D option. Then, select imaging model for 96 well plates. In the matrix selection window, select HydroGel PX-2.53.Enter the cell types as glutamatergic neurons and astrocytes, and cell density as 20 million cells per milliliter. Design the desired plate map by highlighting wells on the plate. Include at least one row of 2D control on plastic in the design.Then, verify that the plate model listed at the top of the window is changed to the intended plate model for use. Using the Download buttons, download the protocol and print file for the plate map. Then, save them to the bio printer-linked computer.Prepare a 0.1%polyethylenimine solution in a borate buffer and filter it through a 0.22-micron filter. Add 100 microliters of 0.1%polyethylenimine solution to each 2D control well of a 96-well plate, and incubate at 37 degrees Celsius for two hours. Then, rinse the wells five times with PBS.Once the wells are dried, add diluted laminin solution into the wells and incubate at 37 degrees Celsius for four hours.

יצירת מפת לוחות וציפוי של בקרה דו-ממדית על בארות פלסטיק להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תאים אנושיים שמקורם ב-iPSC

3D Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures

To begin, maintain sterility by cleaning gloves, cartridges, and culture plates with 70%ethanol. Next, switch on the compressor for the bioprinter and select the initialized button to initialize the printer. Wipe down surfaces inside the printer with 70%ethanol.Using the Print Run button, load the print file and open the Print Protocol PDF. Thaw bioink, activator fluids, and 50 milliliters of complete media at room temperature. Prepare the printing cartridge as instructed in the Print Protocol PDF, ensuring the correct volumes of reagents in specified compartments.Next, add 1.2 milliliters of F3 to C1, 1.2 milliliters of F32 to C2, and 200 microliters of F261 to C4.Remove the polyethylenimine and laminin coated plate from the incubator. Set the plate holder compartment to a low profile plate. Insert the plate in the right hand plate holder compartment of the printer.Remove the lid from the plate and place it in the lid holder. Place the print cartridge into the bioprinter and select the Print Inert Base button to start the print run. After thawing, centrifuge the glutamatergic neurons and astrocytes, aspirate the supernatant and resuspend both cell types separately in one milliliter of complete media.Mix 20 microliters of the cell suspension with the same volume of trypan blue and count the cells to determine viable cell concentration for each cell type. Next, combine 3 million glutamatergic neurons with 1 million astrocytes in a 15 milliliter tube, and add complete media to make a final volume of eight milliliters. Centrifuge the cell suspension and aspirate the supernatant without disturbing the pellet.Suspend the pellet in 200 microliters of activator fluid F299 by pipetting up and down. Place the lids on the cartridge and culture plate, and remove them from the bioprinter. In a biosafety cabinet, add 200 microliters of cell suspension to well C3 of the print cartridge.Reinsert the cartridge into the bioprinter and remove the lid as demonstrated previously. Initiate the print models stage of the print run. Concurrently, replace the laminate media from the 2D control plate with complete media.Insert the bioprinting targeting plate into the bioprinter and remove the lid. Begin the bioprint targeting process. When prompted, remove the targeting plate from the bioprinter.Use the guide to identify locations where droplets can be observed on the plate. Reinsert the targeting plate into the bioprinter to repeat the droplet printing and selection process. When prompted, replace the targeting plate with a cell culture plate.After printing, add complete media to all 3D co-culture wells, and incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Finally, dispose of cartridges and remaining liquids. according to lab protocols.After seven days of printing, almost no single cells remained and interconnecting bundles of neurites and astrocytic projections appeared fortified. Neurite outgrowth increased linearly between 12 to 156 hours. During neurite outgrowth, cell body clusters also increased in size.Cell viability analysis showed that approximately 72%of total cells were live on day four while 29%were dead. Immunostaining confirmed the healthy cell morphology of the bioprinted neurons and astrocytes with both cell types exhibiting outgrowth of cellular protrusions. The glutamatergic phenotype of the neurons was confirmed through immunostaining for glutamate receptor 2.