Name: microbiological rapid on-site evaluation for pulmonary infectious diseases
Uploaded: 2024-03-01T13:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 22 s
Description: Read this Scientific Article Protocol about Microbiological Rapid On-Site Evaluation for Pulmonary Infectious Diseases at JoVE.com

אנו מעריכים את פרויקט התמריץ וההדרכה לביצועים של מוסד המחקר המדעי בצ'ונגצ'ינג (jxyn-2021-1-15 ו- jxyn-2021-2-6) לתמיכה כספית.

הניסוי הקליני אושר על ידי ועדת האישורים של בית החולים צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מס '2022-ky-31). המקרה הטיפוסי כלל חולה שאובחן עם דלקת ריאות פנאומוציסטיס, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופל.
1. דרישות ציוד וחומרים עבור ROSE
<ol><li>ציוד: עיין בקובץ טבלת החומרים עבור הציוד המשמש בפרוטוקול זה. הערה: שימוש במיקרוסקופ ציטולוגי ייעודי ובמערכת הדמיה גרפית הוא הכרחי (איור 1A).</li>
	<li>הכנת חומרים (ראה טבלת חומרים).<ol><li>הכינו שקופיות סטריליות של תרביות תאים (עם הדבקה חזקה של תאים), נייר סופג, כפפות לטקס ללא אבקה, מחטי מזרק חד פעמיות בנפח 2.5-5 מ"ל, והניחו את הסט המלא של תמיסות צביעה של Diff Quik (DQ) בצנצנות צביעת זכוכית עם מכסים אטומים לטיפול קל (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. זרימת עבודה של M-ROSE
<ol><li>הכנת שקופיות ציטולוגיות הערה: קיימות דרכים רבות להכנת שקופיות, ולהלן מספר שיטות הכנה נפוצות.<ol><li>גלגול שקופיות הערה: ודא אובדן מינימלי של דגימת רקמה במהלך תהליך זה.<ol><li>חלצו חלקיקי רקמה באמצעות מחט מזרק חד-פעמית עם קיבולת של 2.5-5 מ"ל (איור 2A).</li>
			<li>פורסים שטח עגול, בקוטר של כ-1 ס"מ ובעובי בינוני, מהשליש הפנימי לחיצוני של הקצה המוכתם (הקצה בעל חיבור תאים חזק) על שקופית הציטולוגיה הסטרילית.</li>
		</ol></li>
		<li>מברשת שקופיות הערה: שיטה זו ישימה לדגימות המתקבלות באמצעות מברשות תאים קונבנציונליות, מברשות תאים מונעות זיהום או מברשות תאים עדינות במיוחד, כמו גם דגימות נוזליות למחצה כגון כיח ונוזלי גוף צמיגים.<ol><li>האריכו את ראש המברשת והניחו אותו על השליש הדיסטלי של מגלשת הזכוכית הציטולוגית הסטרילית (למגלשה תכונות היצמדות תאים חזקות) לקבלת שטח מלבני של כ-2X1 ס"מ בעובי בינוני.</li>
		</ol></li>
		<li>ריסוס שקופיות<ol><li>מקם את מחט הניקוב בשליש מהקצה המוכתם של שקופית ציטולוגיה סטרילית עם היצמדות תאים חזקה.</li>
			<li>הפעילו לחץ אוויר על קצה המחט החודרת והכניסו אותו מהצד הפנימי כלפי חוץ, ויצרו אזור עגול בעובי בינוני בקוטר של כ-1 ס"מ.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>צביעת שקופית ציטולוגית הערה: ארגון הבריאות העולמי (WHO) ממליץ על צביעה מהירה של שקופית ציטולוגית ROSE באמצעות צבע5 של Diff. ניתן לעשות שימוש חוזר בצבע Diff אך לא לחזור עליו פעמים רבות. אם יש משקעים, יש לסנן אותם לאחר השימוש. צביעה עמוקה מדי יכולה להיות דה-צבעית כראוי על ידי מתנול או אלכוהול, רצוי לא צבוע יותר. אם הצביעה עמוקה מדי או רדודה מדי, יש להתאים את זמן הצביעה או את ריכוז נוזל העבודה; לערך ה- pH יש השפעה מסוימת על הצביעה, והמגלשה צריכה להיות נקייה וללא זיהום חומצה ואלקלי. גם תמיסת Diff A וגם תמיסת Diff B נדיפים ויש לאטום ולאחסן אותן לאחר השימוש.<ol><li>השקיעו את השקופית בתמיסת Diff A למשך 10-30 שניות (איור 2B), ואז שטפו אותה באמבט הצבע PBS כדי להסיר תמיסת Diff A עודפת ונערו בעדינות את כל החיץ שנותר (איור 2C).</li>
		<li>לאחר מכן, טבלו את השקופית בתמיסת Diff B למשך 20-40 שניות (איור 2E).</li>
		<li>לבסוף, נקו את השקופית במיכל צביעת המים (איור 2F), נגבו את שאריות הנוזל של המגלשה עם נייר סופג (איור 2D), וסיימו לצבוע. הערה: M-ROSE מאפשר הדמיה ישירה של מיקרואורגניזמים פתוגניים ומקל על הערכת איכות הדגימות הנשימתיות, ומאפשר הבחנה בין זיהום ללא זיהום וכן זיהום וזיהום, שיש לו משמעות מנחה להערכת חומרת הזיהום והפרוגנוזה. פרק הדיון יכסה היבט זה מכיוון שהוא אינו כרוך בהליכים ניסיוניים כלשהם.</li>
	</ol></li>
</ol>

שיפור הטיפול בזיהומים ריאתיים באמצעות M-ROSE

<ol>
	<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+with+rapid+on-site+evaluation+performed+by+endoscopists+in+solid+pancreatic+lesions:+A+prospective,+randomized+controlled+trial.">Diagnostic value of endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration with rapid on-site evaluation performed by endoscopists in solid pancreatic lesions: A prospective, randomized controlled trial.</a> J Gastroenterol Hepatol. 37 (10), 1975-1982 (2022).</li><li>Bruno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+cost+effectiveness+of+rapid+on+site+examination+(ROSE)+in+management+of+patients+with+mediastinal+lymphadenopathies.">Efficacy and cost effectiveness of rapid on site examination (ROSE) in management of patients with mediastinal lymphadenopathies.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17 (11), 1517-1522 (2013).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+rapid+on-site+evaluation:+a+better+method+for+Mucoid+Pseudomonas+Aeruginosa+diagnosis+in+bronchiectasic+patients.">Microbiology rapid on-site evaluation: a better method for Mucoid Pseudomonas Aeruginosa diagnosis in bronchiectasic patients.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 26 (5), 1738-1742 (2022).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microbiological+rapid+on-site+evaluation+in+respiratory+intensive+care+units:+a+retrospective+study.">Application of microbiological rapid on-site evaluation in respiratory intensive care units: a retrospective study.</a> Ann Transl Med. 10 (1), 7 (2022).</li><li>Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+value+of+microbiology+rapid+on-site+evaluation+of+sepsis+caused+by+pulmonary+infection.">The value of microbiology rapid on-site evaluation of sepsis caused by pulmonary infection.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 27 (12), 5862-5868 (2023).</li><li>Muri, R., Trippel, M., Borner, U., Weidner, S., Trepp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+rapid+on-site+evaluation+on+the+quality+and+diagnostic+value+of+thyroid+nodule+fine-needle+aspirations.">The impact of rapid on-site evaluation on the quality and diagnostic value of thyroid nodule fine-needle aspirations.</a> Thyroid. 32 (6), 667-674 (2022).</li><li>Wang, Z., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+rapid+on-site+evaluation+in+contemporary+pediatric+interventional+respiratory+diseases.">Application of rapid on-site evaluation in contemporary pediatric interventional respiratory diseases.</a> Chinese Journal of Practical Pediatrics. 12, 470-475 (2019).</li><li>Shah, P. L., Herth, F. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+interventional+pulmonology.">Progress in interventional pulmonology.</a> Respiration. 95 (5), 287-288 (2018).</li><li>Hsia, D., Musani, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interventional+pulmonology.">Interventional pulmonology.</a> Med Clin North Am. 95 (6), 1095-1114 (2011).</li><li>Moore, A. J., Mercer, R. M., Musani, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+interventional+pulmonology.">Advances in interventional pulmonology.</a> Clin Chest Med. 39 (1), 271-280 (2018).</li><li>Majid, A., Fernandez-Bussy, S., Folch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interventional+pulmonology+and+solitary+pulmonary+nodule.">Interventional pulmonology and solitary pulmonary nodule.</a> Arch Bronconeumol. 54 (10), 497-498 (2018).</li><li>Ali, M. S., Sorathia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palliative+care+and+interventional+pulmonology.">Palliative care and interventional pulmonology.</a> Clin Chest Med. 39 (1), 57-64 (2018).</li><li>Czarnecka, K., Yasufuku, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interventional+pulmonology:+focus+on+pulmonary+diagnostics.">Interventional pulmonology: focus on pulmonary diagnostics.</a> Respirology. 18 (1), 47-60 (2013).</li><li>Schacht, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration:+performance+of+biomedical+scientists+on+rapid+on-site+evaluation+and+preliminary+diagnosis.">Endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration: performance of biomedical scientists on rapid on-site evaluation and preliminary diagnosis.</a> Cytopathology. 27 (5), 344-350 (2016).</li><li>Pearson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+on-site+evaluation+of+fine-needle+aspiration+by+non-cytopathologists:+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+diagnostic+accuracy+studies+for+adequacy+assessment.">Rapid on-site evaluation of fine-needle aspiration by non-cytopathologists: A systematic review and meta-analysis of diagnostic accuracy studies for adequacy assessment.</a> Acta Cytol. 62 (4), 244-252 (2018).</li><li>Arimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiopsy+with+endobronchial+ultrasonography+using+a+guide+sheath+for+peripheral+pulmonary+lesions+and+DNA+analysis+by+next+generation+sequencing+and+rapid+on-site+evaluation.">Cryobiopsy with endobronchial ultrasonography using a guide sheath for peripheral pulmonary lesions and DNA analysis by next generation sequencing and rapid on-site evaluation.</a> Respir Investig. 57 (2), 150-156 (2019).</li><li>Gianella, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+rapid+on-site+cytologic+evaluation+during+endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration+in+malignant+and+nonmalignant+disease.">Utility of rapid on-site cytologic evaluation during endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration in malignant and nonmalignant disease.</a> Acta Cytol. 62 (5-6), 380-385 (2018).</li><li>Natella, V., Cozzolino, I., Sosa Fernandez, L. V., Vigliar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+nodes+fine+needle+cytology+in+the+diagnosis+of+infectious+diseases:+clinical+settings.">Lymph nodes fine needle cytology in the diagnosis of infectious diseases: clinical settings.</a> Infez Med. 20, 12-15 (2012).</li><li>Baughman, R. P., Spencer, R. E., Kleykamp, B. O., Rashkin, M. C., Douthit, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator+associated+pneumonia:+quality+of+nonbronchoscopic+bronchoalveolar+lavage+sample+affects+diagnostic+yield.">Ventilator associated pneumonia: quality of nonbronchoscopic bronchoalveolar lavage sample affects diagnostic yield.</a> Eur Respir J. 16 (6), 1152-1157 (2000).</li><li>Petrone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+cytotechnician+training+influence+the+accuracy+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration+of+pancreatic+masses.">Does cytotechnician training influence the accuracy of EUS-guided fine-needle aspiration of pancreatic masses.</a> Dig Liver Dis. 44 (4), 311-314 (2012).</li></ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

פולמונולוגיה התערבותית היא ענף חשוב של מחלות נשימה מודרניות; בפרט, זה כבר בשימוש נרחב באבחון של מחלות ריאה 8,9. בשנים האחרונות, פולמונולוגיה התערבותית אבחנתית משגשגת בשל שכיחות מוגברת של גידולים ממאירים ריאתיים, יותר זיהומים פתוגניים עמידים לתרופות המתרחשי...

הטכניקה של הערכה מהירה באתר (ROSE) היא שיטה יעילה ביותר המיושמת בתחום הליכי מחלות ריאה. הוא מאפשר דגימה בזמן אמת והתערבות אבחנתית, ומאפשר ניתוח ציטולוגי מיידי1. גישה חדשנית זו כוללת הטבעה של חלק מדגימת הרקמה על שקופית תוך שמירה על שלמותה. אחד היתרונות העיקריים של ROSE טמון ביכולתו להקל על פרשנות מהירה של מידע קליני באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה מיוחדות. זה כולל ניתוח של מורפולוגיה של התא, סיווג, כימות, קביעת יחסים מרכיבים, הערכת סידור, ניתוח מתאם, הערכת רקע, וזיהוי של אובייקטים זרים. על ידי שילוב כל הנתונים הללו עם המידע הקליני של המטופל, ROSE ממלא תפקיד מרכזי בהערכת הלימות הדגימה ובהנחיית הליכים וטכניקות התערבותיות בזמן אמת2.
כחברת בת של טכנולוגיית ROSE, טכנולוגיית M-ROSE מתמקדת בעיקר ברכישת הרקע המיקרוביולוגי של נגעי מטרה במקום להבחין בין תאים שפירים לממאירים 3,4. מצד אחד, M-ROSE מאפשר זיהוי מיקרוסקופי של פתוגנים כגון אספרגילוס, קריפטוקוקוס, פנאומוציסטיס וקנדידה5. מצד שני, יש לו השלכות מנחות משמעותיות בהערכת איכות הדגימות הנשימתיות, הבחנה בין מחלות זיהומיות ללא זיהומיות, הבחנה בין זיהום לזיהום, כמו גם הערכת חומרת זיהום ופרוגנוזה 6,7. לדוגמה, בתוך דגימה נשימתית, דו-קיום של חיידקים בעלי מורפולוגיה זהה לצד חדירת תאי דלקת מצביע על זיהום; לעומת זאת, נוכחותם של חיידקים רבים בעלי מגוון מורפולוגי המלווים בתאי אפיתל מצביעה על זיהום. היכולת לנתח באופן מקיף מידע קליני ולחזות תוצאות הופכת את M-ROSE לכלי רב ערך בהליכים של מחלות ריאה.
לסיכום, ROSE משמש כנשא ציטולוגי חיוני המשפר משמעותית את היעילות והדיוק של אבחון מחלות ריאה. יכולותיו הרב-גוניות תורמות לשיפור תוצאות המטופלים בכך שהן מבטיחות התערבות בזמן ומקלות על אבחון מדויק באמצעות טכניקות דגימה והתערבות אבחונית בזמן אמת. עם זאת, חשוב לציין כי התקדמות זו מסתמכת על השגת דגימות מוסמכות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול M-ROSE סטנדרטי הכולל הכנת שקופיות, טכניקות צביעה והנחיות פרשנות. פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות רבת ערך עבור קלינאים כדי לקבוע תוכניות הערכה וטיפול מדויקות תוך הקלה על קבלת החלטות לגבי טיפול עוקב בדגימות מטרה.

<table><tbody><tr><td>Cytological microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik (DQ) staining solutions</td><td>Besso Biotechnology Co. LTD</td><td>G1541</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 2.5-5 mL syringe needles</td><td>Shandong Zhu Pharmaceutical Group</td><td>20183150304</td><td></td></tr><tr><td>Powder-free latex gloves</td><td>Henan Yadu Industrial Co., LTD</td><td>20182140728</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell culture slides</td><td>Jinan Preret industry and trade Co., LTD</td><td>7101</td><td></td></tr></tbody></table>

microbiological rapid on-site evaluation for pulmonary infectious diseases

ההתחלה המהירה של טיפול אמפירי אנטי זיהומי היא קריטית בחולים המציגים זיהום ריאתי בלתי מוסבר. למרות שרכישת הדמיה היא פשוטה יחסית בפרקטיקה הקלינית, חוסר הספציפיות שלה מחייב לעתים קרובות בדיקות נוספות הגוזלות זמן רב כגון תרבית כיח, תרבית נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי או ריצוף גנטי כדי לזהות את האטיולוגיה הבסיסית של המחלה במדויק. יתר על כן, היעילות המוגבלת של טיפול אמפירי אנטי זיהומי עלולה לתרום לשימוש לרעה באנטיביוטיקה. ההתקדמות האחרונה בפענוח רקע מיקרוביאלי בשקופיות הערכה מהירה באתר (ROSE) אפשרה לרופאים להשיג דגימות במהירות באמצעות ברונכוסקופיה (למשל, שטיפת נאדיות, צחצוח רירית, מהדק רקמות), מה שמקל על צביעה לצד המיטה ופרשנות המספקת מידע רקע מיקרוביאלי חיוני. כתוצאה מכך, זה מבסס בסיס לפיתוח טיפול ממוקד נגד זיהום ותוכניות טיפול תרופתי אישיות. עם הבנה טובה יותר של אילו פתוגנים גורמים לזיהומים בזמן אמת, רופאים יכולים להימנע מאנטיביוטיקה רחבת טווח מיותרת התורמת לעמידות לאנטיביוטיקה. הקמת תהליך עבודה מהיר וסטנדרטי של M-ROSE במחלקות לרפואה נשימתית או ביחידות לטיפול נמרץ תסייע רבות לרופאים לגבש אסטרטגיות טיפול מדויקות לחולים, דבר שיש לו השלכות קליניות משמעותיות.

במקרה טיפוסי, גבר בן 63 הגיע לבית החולים עם שיעול, חום וכאבים בחזה. החולה אובחן בעבר עם תסמונת נפרוטית, המאופיינת בפרוטאינוריה ובבצקת, וקיבל טיפול בפרדניזון וטקרולימוס במשך זמן רב. ממצאי המעבדה הראשוניים הדגימו ספירת תאי דם לבנים של 10.49 x 109/L, ספירת נויטרופילים של 8.87 x 109/L, חלבון מג?...

Read this Scientific Article Protocol about Microbiological Rapid On-Site Evaluation for Pulmonary Infectious Diseases at JoVE.com

מחבר זרקור: קידום זיהוי פתוגנים והערכת מחלות בזמן אמת באמצעות M-ROSE

הפרוטוקול כאן מדגים זרימת עבודה מהירה ומתוקננת של הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר הלקוח (M-ROSE), הכוללת שלושה שלבים: יצירת שקופיות, צביעה ופענוח. פרוטוקול זה יסייע לרופאים לקבל החלטות קליניות מהירות.

הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר למחלות זיהומיות ריאתיות

The prompt initiation of empirical anti-infective therapy is crucial in patients presenting with unexplained pulmonary infection. Although imaging ...

הכוונה שלנו היא להציג שיטת הערכה מהירה בזמן אמת, M-ROSE כדי לסייע לרופאים לגבש אסטרטגיות טיפול מדויקות לחולים עם דלקות ריאה. טכנולוגיית צביעת תאים מהירה ומערכת הדמיה מיקרוסקופית בחדות גבוהה משמשות כיום לקידום המחקר בתחום. מספר המחקרים הקליניים על M-ROSE מוגבל יחסית.האתגר הגדול ביותר הוא פענוח תוצאות M-ROSE, הדורש כוח אדם, וכוח אדם מיומן, שכן קשה לזהות חזותית פתוגנים ולהבדיל בין זיהום לזיהום. עם הבנה טובה יותר של פתוגנים הגורמים לזיהומים בזמן אמת, רופאים יכולים להימנע מאנטיביוטיקה רחבת טווח מיותרת התורמת לעמידות לאנטיביוטיקה וכטיפול בדלקות ריאה. M-ROSE הוא זמן אמת ויעיל ביותר.M-ROSE מאפשר זיהוי מיקרוסקופי של פתוגנים כגון אספרגילוס, קריפטוקוקוס, רבים וקנדידה. יש לו השלכות מנחות משמעותיות על מדידת איכות בסיסית נשימתית, הבחנה בין זיהומים למחלות לא זיהומיות, אפליה, זיהום מזיהום, כמו גם הערכת זיהום, חומרתו ופרוגנוזה.

microbiological-rapid-on-site-evaluation-for-pulmonary-infectious

Research

JoVE Journal

Medicine

Microbiological Rapid On-Site Evaluation for Pulmonary Infectious Diseases

349 Views.  Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine. הכוונה שלנו היא להציג שיטת הערכה מהירה בזמן אמת, M-ROSE כדי לסייע לרופאים לגבש אסטרטגיות טיפול מדויקות לחולים עם דלקות ריאה. טכנולוגיית צביעת תאים מהירה ומערכת הדמיה מיקרוסקופית בחדות גבוהה משמשות כיום לקידום המחקר בתחום. מספר המחקרים הקליניים על M-ROSE מוגבל יחסית.האתגר הג...

Video: מחבר זרקור: קידום זיהוי פתוגנים והערכת מחלות בזמן אמת באמצעות M-ROSE

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world population1, and almost two million people are killed by TB each year.2 Universal access to high-quality, patient-centered treatment for all TB patients is emphasized by WHO's Stop TB Strategy.3 The rapid detection of MTB in respiratory specimens and drug therapy based on reliable drug resistance testing results are a prerequisite for the successful implementation of this strategy. However, in many areas of the world, TB diagnosis still relies on insensitive, poorly standardized sputum microscopy methods. Ineffective TB detection and the emergence and transmission of drug-resistant MTB strains increasingly jeopardize global TB control activities.2
Effective diagnosis of pulmonary TB requires the availability - on a global scale - of standardized, easy-to-use, and robust diagnostic tools that would allow the direct detection of both the MTB complex and resistance to key antibiotics, such as rifampicin (RIF). The latter result can serve as marker for multidrug-resistant MTB (MDR TB) and has been reported in &gt; 95% of the MDR-TB isolates.4, 5 The rapid availability of reliable test results is likely to directly translate into sound patient management decisions that, ultimately, will cure the individual patient and break the chain of TB transmission in the community.2
Cepheid's (Sunnyvale, CA, U.S.A.) Xpert MTB/RIF assay6, 7 meets the demands outlined above in a remarkable manner. It is a nucleic-acids amplification test for 1) the detection of MTB complex DNA in sputum or concentrated sputum sediments; and 2) the detection of RIF resistance-associated mutations of the rpoB gene.8 It is designed for use with Cepheid's GeneXpert Dx System that integrates and automates sample processing, nucleic acid amplification, and detection of the target sequences using real-time PCR and reverse transcriptase PCR. The system consists of an instrument, personal computer, barcode scanner, and preloaded software for running tests and viewing the results.9 It employs single-use disposable Xpert MTB/RIF cartridges that hold PCR reagents and host the PCR process. Because the cartridges are self-contained, cross-contamination between samples is eliminated.6 Current nucleic acid amplification methods used to detect MTB are complex, labor-intensive, and technically demanding. The Xpert MTB/RIF assay has the potential to bring standardized, sensitive and very specific diagnostic testing for both TB and drug resistance to universal-access point-of-care settings3, provided that they will be able to afford it. In order to facilitate access, the Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) has negotiated significant price reductions. Current FIND-negotiated prices, along with the list of countries eligible for the discounts, are available on the web.10

The Xpert MTB/RIF test integrates sample decontamination, hands-free operation, on-board sample processing, and ultra-sensitive hemi-nested PCR for the simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance, either in expectorated sputum or concentrated sputum sediments, in approximately two hours. Testing is standardized and requires only moderate laboratory infrastructure and training.

אבחון שחפת ריאתית עם מבחן אקספרט MTB / RIF

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

Immunology and Infection

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Environment

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על לשעבר Vivo רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

אסטרטגיות בקרה וניטור מיקרוביאליים בסביבות של חדרים נקיים

Microbial Control and Monitoring Strategies for Cleanroom Environments and Cellular Therapies

A well-validated and holistic program that incorporates robust gowning, cleaning, environmental monitoring, and personnel monitoring measures is critical for minimizing the microbial bioburden in cellular therapy manufacturing suites and the corresponding testing laboratories to ensure that the facilities are operating in a state of control. Ensuring product safety via quality control measures, such as sterility testing, is a regulatory requirement for both minimally manipulated (section 361) and more than minimally manipulated (section 351) human cells, tissues, and cellular and tissue-based products (HCT/Ps). In this video, we provide a stepwise guide for how to develop and incorporate the best aseptic practices for operating in a cleanroom environment, including gowning, cleaning, staging of materials, environmental monitoring, process monitoring, and product sterility testing using direct inoculation, provided by the United States Pharmacopeia (USP&lt;71&gt;) and the National Institutes of Health (NIH) Alternative Sterility Testing Method. This protocol is intended as a reference guide for establishments expected to meet current good tissue practices (cGTP) and current good manufacturing practices (cGMP).

מחבר זרקור: אסטרטגיות בקרה וניטור מיקרוביאליות עבור סביבות חדרים נקיים וטיפולים תאיים  

The protocol summarizes the best practices to minimize microbial bioburden in a cleanroom environment and includes strategies such as environmental monitoring, process monitoring, and product sterility testing. It is relevant for manufacturing and testing facilities that are required to meet current good tissue practice standards and current good manufacturing practice standards.

אסטרטגיות בקרה וניטור מיקרוביאליות עבור סביבות חדרים נקיים וטיפולים תאיים

A well-validated and holistic program that incorporates robust gowning, cleaning, environmental monitoring, and personnel monitoring measures is critical ...

Bioengineering

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר למחלות זיהומיות ריאתיות

Transcript

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST