עבודת TIS נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFA1104600), והקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג של סין (LQ23H160011).

1. ייצור התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית
<ol><li>התחל על ידי הכנת ארבע יריעות PMMA בעובי 1 מ"מ באמצעות חיתוך לייזר30, ולאחר מכן להמשיך להדביק אותם יחד כדי ליצור תא מרובע עם רוחב פנימי של 21 מ"מ וגובה של 10 מ"מ.</li>
	<li>לאחר מכן, חברו יריעת PMMA נוספת בעובי 1 מ"מ לתחתית התא כדי לשמש כמחזיק לדיו הביולוגי.</li>
	<li>הצמידו בזהירות שלושה מתמרי עופרת זירקונט טיטנאט (PZT) (כל אחד באורך 20 מ"מ, רוחב 10 מ"מ, עובי 0.7 מ"מ ובתדר תהודה ראשוני של 3 מגה-הרץ, ראו טבלת חומרים) לחלק החיצוני של שלושת הקירות האורתוגונליים של החדר, בהתאמה. ודא שמתמר PZT התחתון ממורכז מתחת לתא.</li>
	<li>חוטי הלחמה לשני האזורים המוליכים של כל מתמר PZT.</li>
	<li>לבסוף, אבטחו את המכשיר על בסיס חלול כדי למנוע מה-PZT התחתון לבוא במגע עם משטחי עבודה אחרים.</li>
</ol>2. הקמת מערכת הרכבה אקוסטית
<ol><li>התחילו בהרכבת המכשיר האקוסטי על במת מיקרוסקופ, המאפשרת תצפית מלמעלה על פנים החדר.</li>
	<li>מקם מיקרוסקופ דיגיטלי בצד המכשיר ללא מתמרי PZT, המאפשר תצפית צידית על פנים התא.</li>
	<li>חבר באופן עצמאי את החוטים משלושת מתמרי PZT בסדרה לשלושה מגברי הספק ולשלושה ערוצי פלט של מחוללי פונקציות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>תכנת את ההגדרות על מחוללי הפונקציות עבור כל מתמר PZT, תוך ציון פרמטרים כגון צורת גל סינוסואידית, תדר ומשרעת.</li>
	<li>כדי להבטיח עיקור, מלא את התא של המכשיר האקוסטי עם 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן ניקוי יסודי עם פתרון PBS סטרילי. לאחר מכן, להקרין את החדר עם אור UV בספסל נקי במשך מינימום של 1 שעות.</li>
</ol>3. תרבית תאים והליך הקציר
<ol><li>התחל בגידול תאי C3A, קו תאי קרצינומה הפטוצלולרי אנושי, בבקבוק תרבית תאי T25 באמצעות מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כאשר תאי C3A מגיעים למפגש של כ-80%, בצעו מעבר תאים באופן הבא: ראשית, שטפו את תחתית בקבוק התרבית פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק תרבית התאים ודגרו בטמפרטורה של 37°C כדי להקל על ניתוק התא. עצור את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.</li>
	<li>העבר את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה התא.</li>
</ol>4. הכנת הביו-דיו
<ol><li>הכינו תמיסת GelMA 6% (w/v) המכילה 0.5% (w/v) ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) על ידי המסת 0.3 גרם GelMA ו-0.025 גרם LAP (ראו טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט (PBS). הניחו לתערובת לשבת באמבט מים בטמפרטורה של 47°C למשך שעה אחת.</li>
	<li>לפני ערבוב עם תאים, להעביר את תמיסת GelMA דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) לעיקור.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת התא שהוזכרה לעיל (שלב 3.3) בתווך תרבית התא. צבעו נפח קטן של תאים בתמיסת טריפאן כחולה של 0.4% ולאחר מכן השתמשו בהמוציטומטר נקי לספירת תאים.</li>
	<li>ערבבו כמות מתאימה של תאי C3A, המחושבת על בסיס צפיפות התאים שהתקבלה לעיל, עם תמיסת GelMA מעוקרת להכנת הביודיו עם צפיפות תאים של 2 × 106 תאים / מ"ל.</li>
	<li>להדמיה של כדורי התאים שהורכבו, הכתימו מראש את תאי C3A על ידי דגירה שלהם עם מעקב תאים של 2 מיקרומטר (צבע DiO, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים המסומנים בתרבית תאים טרייה שלוש פעמים לפני השימוש.</li>
</ol>5. הרכבת כדורי התא באמצעות המכשיר האקוסטי
<ol><li>פיפטה יותר מ 1 מ"ל של bioink לתוך החדר מעוקר. ודא שהמרחק פנים אל פנים בין פני השטח הנוזליים לתחתית התא הוא כפולה שלמה של מחצית מאורך הגל האקוסטי. הערה: ניתן לשלוט במרחק זה על-ידי התאמת נפח הדיו הביולוגי שנוסף. ניתן להעריך את אורך הגל האקוסטי (λ) באמצעות הנוסחה λ = c/f, כאשר c מייצג את מהירות הקול בתווך, ו- f הוא התדר של מתמר PZT.</li>
	<li>הפעל את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח כדי להתחיל את ההפעלה של כל מתמר PZT. הערה: מומלץ להפעיל תחילה בנפרד כל מתמר PZT כדי להשיג את התבנית התאית האופטימלית של קו מקבילי. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע טאטוא תדרים בגודל צעד של 0.001 מגה-הרץ ליד תדר התהודה העיקרי עבור כל מתמר PZT. לאחר מכן, יישמו בו זמנית את האותות האופטימליים האלה על כל שלושת מתמרי PZT כדי לקבל את התבנית התאית הצפויה של נקודות תלת-ממדיות. לפני החלת כל אות קלט, ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בדיו הביולוגי על ידי תסיסה עדינה.</li>
	<li>הצליבו את הדיו הביולוגי באמצעות אור כחול (405 ננומטר, 60 mW/cm2, 30 שניות) ליצירת פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי העוטף את אגרגטי התאים שהורכבו אקוסטית. לאחר מכן, כבה את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח.</li>
	<li>העבירו בזהירות את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי מהחדר לצלחת פטרי וחתכו אותו לחתיכות קטנות (למשל, 2 מ"מ × 2 מ"מ × 2 מ"מ) באמצעות סכין גילוח נקי.</li>
	<li>הוסף מדיום תרבית תאים לטיפוח. הערה: זכור לשנות את מדיום התרבות מדי יום.</li>
</ol>6. אחזור ספרואידים של תאים
<ol><li>התחילו בהתבוננות בהיווצרות ספרואידים בשכבות שונות של הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>לאחר 3 ימי תרבית, הסירו את מדיום התרבית ושטפו היטב את פיגומי ההידרוג'ל פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לדגור על הפיגומים עם יותר מ 2 מ"ל של חיץ ליזה GelMA בדילול 1: 200 עם מדיום תרבית תאים במשך 30 דקות באינקובטור התא. צעד זה נועד להמיס את פיגומי ההידרוג'ל.</li>
	<li>להעביר את התמיסה מן השלב הקודם לתוך צינור ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת הספרואיד התא.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי ליישומים במורד הזרם.</li>
</ol>7. ניתוח כדאיות ספרואידית
<ol><li>הערך את הכדאיות של כדורי תאים בתוך פיגומי ההידרוג'ל או בתוך הספרואידים שאוחזרו באמצעות ערכת צביעה חיה/מתה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לדגור על הדגימות בנקודות זמן תרבית שונות עם 1 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 1 μL של Calcein-AM ו 2 μL של Propidium יודיד (PI) במשך 15 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>עבור דגימות בתוך פיגומים הידרוג'ל, לשטוף אותם ישירות עם PBS פעמיים. עבור ספרואידים שהוחזרו, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה ספרואידית, ולשטוף אותו פעמיים לפני התצפית.</li>
	<li>התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכוד את התמונות הפלואורסצנטיות.</li>
	<li>חשב את היחס בין האזור המוכתם ב- Calcein-AM לשטח הכולל המוכתם הן ב- Calcein-AM והן ב- PI באמצעות ImageJ כדי לקבוע את הכדאיות הספרואידית.</li>
</ol>

ייצור מדרגי של כדורי תאים אחידים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית

<ol>
	<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+tumor+application,+advantages,+and+disadvantages.">3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).</li><li>Decarli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spheroids+as+a+versatile+research+platform:+formation+mechanisms,+high+throughput+production,+characterization+and+applications.">Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications.</a> Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).</li><li>Lee, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spheroids+potentiating+cell-cell+and+cell-ECM+interactions+by+self-assembly+of+stem+cell+microlayer.">Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer.</a> Biomaterials. 165, 105-120 (2018).</li><li>Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+spheroids+as+building+blocks+towards+3d+bioprinting+of+tumor+microenvironment.">Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment.</a> International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+drug+screening+based+on+massive+3d+tumor+cultures+using+micropatterned+array+chips.">Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips.</a> Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).</li><li>Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microsystems+for+spheroid+and+organoid+studies.">Engineered microsystems for spheroid and organoid studies.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).</li><li>Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multi-cellular+spheroids+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+acoustic+manipulation+of+living+cells+and+organisms+based+On+2D+array.">3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).</li><li>Armstrong, J. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+anisotropic+muscle+tissue+using+acoustic+cell+patterning.">Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning.</a> Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).</li><li>Drinkwater, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+acoustical+tweezers-devices,+forces,+and+biomedical+applications.">A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications.</a> Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).</li><li>Bouyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bio-Acoustic+Levitational+(BAL)+assembly+method+for+engineering+of+multilayered,+3d+brain-like+constructs,+using+human+embryonic+stem+cell+derived+neuro-progenitors.">A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors.</a> Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).</li><li>Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-assisted+biofabrication+and+bioprinting+of+preferentially+aligned+three-dimensional+cellular+constructs.">Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs.</a> Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+assembly+of+cell+spheroids+in+disposable+capillaries.">Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries.</a> Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+hydrogel+arrays+individually+encapsulating+acoustic+formed+multicellular+aggregates+for+high+throughput+drug+testing.">On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acoustofluidic+focusing+and+separation+of+rare+tumor+cells+using+transparent+lithium+niobate+transducers.">The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+acoustofluidic+fabrication+of+tumor+spheroids.">High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids.</a> Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).</li><li>Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cell+spheroids+using+Standing+Surface+Acoustic+Wave+(SSAW).">Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW).</a> International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).</li><li>Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+waves+that+make+the+pattern:+a+review+on+acoustic+manipulation+in+biomedical+research.">The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research.</a> Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).</li><li>Harley, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+biofabrication+techniques+towards+functional+bioprinted+heterogeneous+engineered+tissues:+A+comprehensive+review.">Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review.</a> Bioprinting. 23, 00147 (2021).</li><li>Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+and+applications+of+surface+and+bulk+acoustic+wave+devices:+a+review.">Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review.</a> Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+holographic+cell+patterning+in+a+biocompatible+hydrogel).">Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel).</a> Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).</li><li>Miao, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+cell+spheroids+with+3D+acoustic+assembly+devices.">High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).</li><li>Jeger-Madiot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+culture+of+Mesenchymal+Stem+Cell+spheroids+in+acoustic+levitation.">Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+assembly+of+3D+neurospheroids+to+model+Alzheimer's+disease.">Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease.</a> Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).</li><li>Mei, J., Zhang, N., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+surface+acoustic+wave+devices+on+lithium+niobate.">Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).</li><li>Niculescu, A. G., Chircov, C., B&#238;rc&#259;, A. C., Grumezescu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+applications+of+microfluidic+devices:+a+review.">Fabrication and applications of microfluidic devices: a review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ייצור יעיל ויציב של ספרואידים של תאים עם תפוקה גבוהה באמצעות טכנולוגיות כמו התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית טומן בחובו הבטחה גדולה לקידום הנדסה ביו-רפואית וסינון תרופות 1,2,3. גישה זו מפשטת את הייצור ההמוני של ספרואידים תאים באמצעות הליכי?...

מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, המספקים יותר מאפיינים מבניים ומורפולוגיים דמויי vivo בהשוואה למודלים קונבנציונליים של תרביות דו-ממדיות, הוכרו כמערכות מבטיחות ביישומים ביו-רפואיים שונים כגון הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות 1,2,3. כסוג אחד של מודל תרבית תלת-ממדי, ספרואידים של תאים מתייחסים בדרך כלל לצבירת תאים, ויוצרים מבנים ספרואידים תלת-ממדיים המאופיינים באינטראקציות משופרות בין תא לתא ולמטריצה התאית 4,5,6. לכן, ייצור ספרואידים של תאים הפך לכלי רב עוצמה המאפשר מחקרים ביולוגיים מגוונים.
טכניקות שונות, כולל טיפה תלויה7, לוחות לא דביקים8, או מכשירי מיקרווול9, פותחו כדי להשיג ספרואידים. באופן עקרוני, שיטות אלה בדרך כלל מקלות על הרכבת תאים על ידי ניצול כוחות פיזיקליים כגון כוח כבידה תוך מזעור אינטראקציות בין התאים למצע. עם זאת, לעתים קרובות הם כרוכים בתהליכים עתירי עבודה, בעלי פרודוקטיביות נמוכה, ומציבים אתגרים לשליטה בגודלהספרואיד 10,11. חשוב לציין, ייצור ספרואידים בגודל ובאחידות הרצויים בכמות מספקת הוא בעל חשיבות עליונה כדי לספק יישומים ביולוגיים ספציפיים. בניגוד לשיטות שהוזכרו לעיל, גלים אקוסטיים, כסוג אחד של טכניקה מונעת כוח חיצוני 12,13,14, הראו פוטנציאל לייצור המוני של ספרואידים תאים באיכות ובתפוקה גבוהות, בהתבסס על העיקרון של שיפור צבירת תאים באמצעות כוחות חיצוניים 15,16,17,18. שלא כמו כוחות אלקטרומגנטיים או מגנטיים, טכניקות מניפולציה של תאים מבוססות אקוסטיקה אינן פולשניות ונטולות תוויות, ומאפשרות היווצרות ספרואידים עם תאימות ביולוגית מצוינת19,20.
בדרך כלל, התקנים מבוססי גלים אקוסטיים של משטח עומד (SAWs) וגלים אקוסטיים בתפזורת (BAWs) פותחו כדי ליצור ספרואידים, תוך ניצול הצמתים האקוסטיים (ANs) המיוצרים על ידי שדות אקוסטיים עומדים תואמים 21,22,23. במיוחד, התקני הרכבה אקוסטית המבוססים על BAWs, עם היתרונות של ייצור נוח, הפעלה קלה ומדרגיות מעולה, זכו לתשומת לב לייצור ספרואידים תא24,25. לאחרונה פיתחנו מכשיר הרכבה אקוסטית מבוסס BAWs עם היכולת לייצר ספרואידים עם תפוקה גבוהה26. המכשיר המוצע מורכב מתא פולימתיל מתקרילט ריבועי (PMMA) עם שלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT) המסודרים בהתאמה במישור X/Y/Z. סידור זה מאפשר יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מורחפים (LANs) להנעת הרכבת תאים. בהשוואה להתקנים מבוססי BAW או SAWs שדווחו בעבר, אשר יכולים ליצור רק מערך 1D או 2D של ANs 27,28,29, המכשיר הנוכחי מאפשר מערך נקודות תלת-ממדי של רשתות LAN ליצירת צבירת תאים מהירה בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA). לאחר מכן, צברי תאים הבשילו לספרואידים עם כדאיות גבוהה בתוך פיגומי GelMA פוטוריפו לאחר שלושה ימים של גידול. לבסוף, מספר רב של ספרואידים בגודל אחיד הושגו בקלות מפיגומים GelMA עבור יישומים במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>Used for GelMA solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm-cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RHD25</td>
			<td>Fluorescent cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO dye</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1038</td>
			<td>Dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG5352</td>
			<td>For RF signal generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA</td>
			<td>Regenovo</td>
			<td>none</td>
			<td>Used to prepare bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA lysis buffer</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-LS-001</td>
			<td>Used to dissolve GelMA scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-U</td>
			<td>Cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900889</td>
			<td>Used as photoinitiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td>Cell vability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010002</td>
			<td>Used as buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Prevent cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifer</td>
			<td>Minicircuit</td>
			<td>LCY-22+</td>
			<td>Increase the voltage amplitude of the RF signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT transducers</td>
			<td>Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.</td>
			<td>PZT-41</td>
			<td>Functional units for acoustic assembly device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids

ספרואידים של תאים הם מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבטיחים שזכו ליישומים נרחבים בתחומים ביולוגיים רבים. פרוטוקול זה מציג שיטה לייצור ספרואידים תאים באיכות גבוהה ובתפוקה גבוהה באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית באמצעות הליכים הניתנים לתמרון. התקן ההרכבה האקוסטית מורכב משלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT), שכל אחד מהם מסודר במישור X/Y/Z של תא פולימתיל מתקרילט מרובע (PMMA). תצורה זו מאפשרת יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מרחפים (LAN) בעת החלת שלושה אותות. כתוצאה מכך, תאים בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA) יכולים להיות מונעים ל- LANs, ויוצרים צברי תאים אחידים בשלושה ממדים. לאחר מכן, תמיסת GelMA עוברת פוטוקורפינג UV ומקושרת כדי לשמש כפיגום התומך בצמיחה של אגרגטים של תאים. לבסוף, המוני ספרואידים בשלים מתקבלים ונשלפים על ידי המסה לאחר מכן של פיגומי GelMA בתנאים קלים. המכשיר החדש המוצע להרכבת תאים אקוסטיים בתלת ממד יאפשר ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים תאיים, ואפילו אורגנואידים, ויציע טכנולוגיה פוטנציאלית גדולה בתחום הביולוגי.

3D in vitro culture models, which provide more in vivo-like structural and morphological characteristics compared to conventional 2D culture models, have been recognized as promising systems in various biomedical applications such as tissue engineering, disease modeling, and drug screening1,2,3. As one type of 3D culture model, cell spheroids typically refer to cell aggregation, creating 3D spheroidal structures characterized by enhanced cell-cell and cell-matrix interactions4,5,6. Therefore, fabricating cell spheroids has become a powerful tool for enabling diverse biological studies.
Various techniques, including hanging drop7, non-adhesive plates8, or microwell devices9, have been developed to obtain spheroids. In principle, these methods commonly facilitate cell assembly by utilizing physical forces such as gravitational force while minimizing interactions between cells and the substrate. However, they often involve labor-intensive processes, have low productivity, and pose challenges for controlling spheroid size10,11. Importantly, the production of spheroids with the desired size and uniformity in sufficient quantity is of utmost importance to satisfy specific biological applications. In contrast to the above-mentioned methods, acoustic waves, as one type of external-force-driven technique12,13,14, have shown potential for mass manufacturing of cell spheroids with high quality and throughput, based on the principle of enhancing cell aggregation through external forces15,16,17,18. Unlike electromagnetic or magnetic forces, acoustic-based cell manipulation techniques are non-invasive and label-free, enabling spheroid formation with excellent biocompatibility19,20.
Commonly, standing surface acoustic waves (SAWs) and bulk acoustic waves (BAWs)-based devices have been developed to generate spheroids, utilizing the acoustic nodes (ANs) produced by corresponding standing acoustic fields21,22,23. Particularly, acoustic assembly devices based on BAWs, with the merits of convenient manufacture, easy operation, and excellent scalability, have gained attention for fabricating cell spheroids24,25. We have recently developed a facile BAWs-based acoustic assembly device with the ability to generate spheroids with high throughput26. The proposed device consists of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber with three lead zirconate titanate (PZT) transducers arranged respectively in the X/Y/Z plane. This arrangement enables the creation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) for driving cell assembly. Compared to previously reported BAWs- or SAWs-based devices, which can only create a 1D or 2D array of ANs27,28,29, the present device enables a 3D dot-array of LANs for rapid cell aggregate formation within the gelatin methacryloyl (GelMA) solution. Subsequently, cell aggregates matured into spheroids with high viability within the photocured GelMA scaffolds after three days of cultivation. Finally, a large number of spheroids with uniform size were easily obtained from the GelMA scaffolds for downstream applications.

מחבר זרקור: פיתוח שיטת הרכבה אקוסטית ללא פיגומים לתרבית תאי תלת מימד באיכות גבוהה 

התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

3D in vitro culture models, like cell spheroids, have been widely used in the fields of tissue engineering, disease modeling, and drug screening. Our research focuses on developing and invest per engineering method to fabricate spheroids or other 3D in vitro culture models with high quality for diverse biological studies. In the current protocol, the spheroids grew within the GelMA scaffold and are retrieved at the final layback, dissolving the scaffold, causing additional procedures.We will try to acoustically assemble cell aggregates in a cultural medium to enable them to grow within spheroids without scaffold. Compared to magnetic assembly techniques, acoustic waves can directly assemble cells in a label-free manner without potential toxic effects on cells. Besides, our protocol enables cell spheroids to be assembled in a three-dimensional array, substantially increasing throughput.

מחקר זה תכנן התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית לייצור המוני של ספרואידים תאיים. המכשיר האקוסטי כלל תא מרובע עם שני מתמרי PZT המחוברים למישור X ולמישור Y על פני השטח החיצוניים של התא ומתמר PZT אחד בתחתית התא (איור 1A,B). שלושה ערוצי פלט משני מחוללי פונקציות חוברו לשלושה מגברי ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Scaffold-Free Acoustic Assembly Method for High-Quality 3D Cell Spheroid Culture at JoVE.com

ספרואידים של תאים נחשבו למודל פוטנציאלי אחד בתחום היישומים הביולוגיים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מדרגי של ספרואידים של תאים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית, המספק שיטה יעילה לייצור חזק ומהיר של ספרואידים אחידים של תאים.

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, כמו ספרואידים של תאים, נמצאים בשימוש נרחב בתחומי הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות. המחקר שלנו מתמקד בפיתוח והשקעה לפי שיטה הנדסית לייצור ספרואידים או מודלים אחרים של תרביות מבחנה תלת-ממדיות באיכות גבוהה למחקרים ביולוגיים מגוונים. בפרוטוקול הנוכחי, הספרואידים גדלו בתוך פיגום GelMA ונשלפים בשכיבה הסופית, ממיסים את הפיגום וגורמים לפרוצדורות נוספות.ננסה להרכיב אקוסטית צברי תאים בתווך תרבותי כדי לאפשר להם לגדול בתוך ספרואידים ללא פיגומים. בהשוואה לטכניקות הרכבה מגנטיות, גלים אקוסטיים יכולים להרכיב תאים ישירות באופן ללא תוויות ללא השפעות רעילות פוטנציאליות על התאים. חוץ מזה, הפרוטוקול שלנו מאפשר להרכיב ספרואידים של תאים במערך תלת ממדי, מה שמגדיל משמעותית את התפוקה.

three-dimensional-acoustic-assembly-device-for-mass-manufacturing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

785 Views.  Hangzhou Dianzi University. מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, כמו ספרואידים של תאים, נמצאים בשימוש נרחב בתחומי הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות. המחקר שלנו מתמקד בפיתוח והשקעה לפי שיטה הנדסית לייצור ספרואידים או מודלים אחרים של תרביות מבחנה תלת-ממדיות באיכות גבוהה למחקרים ביולוגיים מגוונ...

Video: מחבר זרקור: פיתוח שיטת הרכבה אקוסטית ללא פיגומים לתרבית תאי תלת מימד באיכות גבוהה 

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Setting Up an Acoustic Assembly System and Cell Culture Harvesting for Generating Uniform Cell Spheroids

To begin, sterilize the chamber of the acoustic device with 75%alcohol for five minutes. Then, clean the device with sterile PBS and irradiate it with UV light for one hour. Mount the sterile acoustic device onto a microscope stage for top-view observation of the chamber's interior.Position a digital microscope on the side of the device that is free from PZT transducers, enabling side-view observation of the chamber's interior. Independently connect the wires from the three PZT transducers in series to three power amplifiers and three output channels of function generators. Program the settings on the function generators for each PCT transducer, specifying parameters such as sinusoidal waveforms, frequency, and amplitude.Culture 3CA cells in DMEM supplemented with 10%FBS and 1%penicillin streptomycin in a T25 cell culture flask. When the cells become 80%confluent, wash the culture twice with PBS. After removing the PBS, add two milliliters of 0.05%trypsin-EDTA to the flask and incubate at 37 degrees Celsius for cell detachment.Add two milliliters of complete cell culture medium into the flask to stop the trypsinization. Transfer the cell suspension to a 15-milliliter tube and centrifuge at 200 G for five minutes.

הקמת מערכת הרכבה אקוסטית וקצירת תרביות תאים ליצירת ספרואידים אחידים של תאים

Bioink Preparation, Acoustic Device Assembly, and Viability Analysis of Cell Spheroids

To prepare the bio ink solution mix an appropriate amount of C3A cell suspension with the sterilized gelMA solution. Prestain the C3A cell spheroids with two micromolar cell tracker solution at 37 degrees for 20 minutes. To wash the cells, first, remove the supernatin by centrifuging and then add fresh cell culture medium.Add at least two milliliters of bio ink into the sterilized acoustic device chamber. Turn on the function generator and power amplifier to initiate the actuation of each PZT transducer to generate a 3D array of cell aggregates. Crosslink the bio ink using blue light for 30 seconds to create 3D hydrogel scaffolds, encapsulating the assembled cell aggregates acoustically.Next, carefully transfer the 3D hydrogel scaffold from the chamber into a Petri dish. Cut it into small pieces using a clean razor, and then add cell culture medium into the Petri dish. Incubate the C3A cell spheroids at different culture time points in one milliliter of PBS containing one microliter of calcium am and two microliters of propidium iodide for 15 minutes at 37 degrees Celsius.Rinse the sample embedded in hydrogel scaffolds twice with PBS. For retrieved spheroids, perform centrifugation at 200 G for five minutes and wash twice with PBS. Using a fluorescence microscope, observe the spheroids and capture the images.The cell aggregates were arranged in the regular 3D dot array pattern with a green fluorescent signal. The assembled C3A gelMA aggregates gradually integrated and formed tight spheroids by day three, accompanied by an increase in spheroid diameter. The viability of the cell spheroids remained good before day three, but slightly decreased after a week of culture.The released spheroids maintained a good spherical morphology with a narrow size distribution along with desirable viability and expression of albumin.