המחברים אסירי תודה למעבדה האנדרולוגית של המרכז לרפואת רבייה, בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן, על אספקת המתקנים למחקר זה. לא היה מעורב מימון בהכנת מאמר זה.

מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים המסונף השלישי של אוניברסיטת סון יאט-סן.
1. הכנת פתרון העבודה
<ol><li>אסוף את הריאגנטים הבאים החיוניים להכנת תמיסת העבודה - תמיסת מצע אורתו-טולוידין, תמיסת אמוניום כלורי רווי (NH4Cl), תמיסת מלח דיסודיום 148 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (Na2EDTA) ותמיסת מי חמצן 6% (v/v). הניחו אותם על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר (RT) יחד עם הכלים הדרושים, כגון פיפטות העברה (1000 μL, 200 μL, 10 μL) ומדפי מבחנה. התראה: קרא את גיליון נתוני הבטיחות (SDS) לפני הטיפול בריאגנטים שהוזכרו לעיל.</li>
	<li>הכינו בקבוק מגיב חום אטום לאחסון והגנה על פתרון העבודה המוכן מפני חשיפה לאור.</li>
	<li>העבירו את הריאגנטים לבקבוק מגיב חום אטום בהתאם לפרופורציות המפורטות להלן:<ol><li>נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 100 μL של תמיסת NH4Cl לבקבוק מגיב חום אטום.</li>
		<li>החלף את קצה פיפטה והעבר 100 μL של תמיסת 148 mmol / L Na2EDTA לבקבוק מגיב חום אטום באמצעות פיפטת העברה 200 μL שהוזכרה לעיל. לאחר מכן, לנשוף בעדינות על ידי pipetting ו homogenize ביסודיות את הפתרון.</li>
		<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, להעביר 900 μL של תמיסת המצע ortho-toluidine לתוך בקבוק מגיב חום אטום, לנשוף בעדינות על ידי pipetting, והומוגני ביסודיות את התמיסה.</li>
		<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-5 μL על ידי סיבוב הידית. לאחר מכן, העבירו 5 μL של תמיסת מי חמצן 6% (v/v) לבקבוק מגיב חום אטום.</li>
	</ol></li>
	<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. מחליפים את קצה הפיפטה, נושפים בעדינות על ידי פיפטינג, ומהומוגניים היטב את התמיסה בבקבוק מגיב חום אטום.</li>
	<li>אחסן את פתרון העבודה המוכן לשימוש בבקבוק מגיב חום אטום ב- RT, הרחק מאור. פתרון העבודה הוא תגובתי במשך 24 שעות.</li>
	<li>כל דגימת זרע דורשת 900 μL של פתרון העבודה. יש לוודא כי כמות פתרון העבודה המוכן בכל יום תואמת את מספר הדגימות הנבדקות מדי יום.</li>
</ol>2. הכנת דגימת זרע
<ol><li>לפני איסוף דגימת הזרע, ודא שהמטופל נמנע משפיכה במשך 2 עד 7 ימים כנדרש במדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד זרע אנושי (מהדורה 5). 8. אוננות היא השיטה המועדפת לקבלת דגימות זרע. כדי לשפר את דיוק הבדיקה, להנחות את המטופל לאסוף את כל הזרע שנפלט.</li>
	<li>הפעל את עמדת הטמפרטורה הקבועה וחמם עד 37 מעלות צלזיוס מראש, כך שהנזלה הבאה של דגימת הזרע תוכל להמשיך בצורה חלקה.</li>
	<li>עם קבלת דגימת הזרע של המטופל, יש לתעד בקפדנות מידע מפורט, כולל קוד זיהוי, זמן איסוף, משך התנזרות ומידע רלוונטי אחר, על הקיר החיצוני של כלי הקיבול מבוסס הפולימר.</li>
	<li>הניחו את כלי הקיבול על בסיס פולימר המאכלס את דגימת הזרע על מעמד הטמפרטורה הקבוע שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס, מה שמועיל להנזלת הזרע.</li>
	<li>ציירו את דגימת הזרע לתוך פיפטה על בסיס פולימר והתבוננו במצב ההנזלה כל 5 דקות עד שדגימת הזרע נוזלית במלואה.</li>
	<li>אם דגימת הזרע לא נוזלה במלואה תוך 30 דקות, אל תבצע את הבדיקה עדיין; המשיכו להמתין עוד 30 דקות. אם הזרע עדיין לא נוזלי במלואו לאחר 60 דקות, הוסף נפח שווה של תמיסת חיץ פוספט לדילול 1:1 והתסיס בעדינות כדי לקדם הנזלה.</li>
	<li>לאחר תסיסה יסודית והומוגניזציה עקבית, שמור על דגימת הזרע הנוזלית במלואה להליכי הבדיקה הבאים.</li>
</ol>3. צביעה של לויקוציטים חיוביים peroxidase וניתוח מדגם הזרע המקורי
<ol><li>לפני הדגימה, יש להשתמש בפיפט על בסיס פולימר כדי לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית בדגימת הזרע הנבדקת.</li>
	<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 200 μL וכווננו את קנה המידה ל-100 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 100 μL של דגימת הזרע לתוך צינור צנטריפוגה.</li>
	<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-900 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה פיפטה, ולאחר מכן להעביר 900 μL של פתרון העבודה הנ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה.</li>
	<li>מכה חוזרת ונשנית על ידי pipetting הומוגניזציה ביסודיות את המגיב, אשר מורכב מדגם זרע פתרון עבודה, באמצעות פיפטה העברה 1000 μL.</li>
	<li>מקם את צינור הצנטריפוגה במתלה מבחנה על שייקר דו-ממדי והפעל תסיסה רציפה ב-200 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.</li>
	<li>בזמן ההמתנה לתגובת הצביעה, נתח את דגימת הזרע באמצעות מערכת CASA כדי לקבוע את ריכוז הזרעונים בדגימת הזרע המקורית בכלי הקיבול מבוסס הפולימר.<ol><li>הפעל את מתג ההפעלה של מערכת CASA ולחץ פעמיים על סמל SCA SCOPE כדי לפתוח את תוכנת היישום.</li>
		<li>לפני הדגימה, יש לנשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג ולבצע הומוגניות יסודית של דגימת הזרע המקורית שוב עם פיפטה על בסיס פולימר.</li>
		<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, פיפטה עד 10 μL של דגימת הזרע המקורית, והכנס אותו לתא ספירת SCA. המתן 60 שניות עד שדגימת הזרע תפסיק להיסחף.</li>
		<li>מקם את תא ספירת ה- SCA על מחזיק הדגימה של מערכת CASA והגדר את פרטי המטופל בתיבת הדו-שיח של תוכנת היישום כדי להתכונן לבדיקה הרשמית.</li>
		<li>בדוק את דגימת הזרע המקורית בתא ספירת SCA עם מערכת CASA על ידי לחיצה על לחצן התחל ורשום את הנתונים הדרושים, כגון ריכוז הזרעונים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. תצפית על לויקוציטים חיוביים peroxidase ו spermatozoa
<ol><li>נצלו את פיפטת ההעברה של 1000 μL וכווננו את קנה המידה ל-1000 μL על ידי סיבוב הידית. החלף את קצה הפיפטה, ואז נשוף שוב ושוב על ידי פיפטינג והומוגניזציה יסודית של המגיב, המורכב מדגימת זרע ותמיסת עבודה בצינור הצנטריפוגה שוב בסוף תהליך התגובה של 30 דקות.</li>
	<li>נצלו את פיפטת ההעברה של 10 μL וכווננו את קנה המידה ל-10 μL על ידי סיבוב הידית. החליפו את קצה הפיפטה, פיפטה במעלה 10 מיקרוליטר של המגיב שהוזכר לעיל, והכניסו אותה לתא ספירת הזרע. לבסוף, כסו את תא ספירת הזרע בכיסוי זכוכית ייעודי.</li>
	<li>הניחו את תא ספירת הזרע על השלב המיקרוסקופי והפעילו את מתג ההפעלה של המיקרוסקופ האופטי באמצעות שתי עיניות 10x. לאחר מכן, המתן 60 שניות עד שהדגימה המגיבה תפסיק להיסחף.</li>
	<li>העבר את הממיר המיקרוסקופי לעדשת האובייקט 10x במהלך זמן ההמתנה. לאחר מכן כוונן את ידית הכוונון הגסה ואת ידית הכוונון העדינה ברצף. לבסוף, התבוננו בזרעונים ובתאים עגולים תחת הגדלה של 10×10.</li>
	<li>החלף את הממיר המיקרוסקופי לעדשה האובייקטיבית 40x לאחר קביעת שדה הראייה שיש לנתח, והתבונן בזרעונים ובלויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום תחת הגדלה של 10 × 40.</li>
	<li>השתמש במערכת המונה האלקטרוני כדי לספור לפחות 200 זרעונים ואת מספר לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז חום בתוך השדות המתאימים.</li>
</ol>5. חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase
<ol><li>חישוב הריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66211/66211eq01v2.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

ניתוח זרע עבור תאי לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז

<ol>
	<li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe.">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).</li><li>Sharlip, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practice+policies+for+male+infertility.">Best practice policies for male infertility.</a> Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).</li><li>Choy, J. T., Eisenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+infertility+as+a+window+to+health.">Male infertility as a window to health.</a> Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).</li><li>Pellati, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genital+tract+infections+and+infertility.">Genital tract infections and infertility.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).</li><li>Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+management+of+male+genital+tract+infections+in+the+setting+of+male+infertility:+an+updated+review.">Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review.</a> Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).</li><li>Long, S., Kenworthy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+cells+in+diagnostic+semen+analysis:+A+guide+for+laboratories+and+clinicians.">Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians.</a> Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).</li><li>Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+'round+cells'+in+semen+analysis:+a+comparative+study.">Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study.</a> Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Laboratory+Manual+for+the+Examination+and+Processing+of+Human+Semen.+5th+edn.">WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Domes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+and+effect+of+bacteriospermia+and+elevated+seminal+leukocytes+on+semen+parameters.">The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters.</a> Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).</li><li>Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+associations+between+specific+sperm+morphological+defects+and+leukocytospermia.">Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia.</a> Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).</li><li>Alahmar, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxidative+stress+in+male+infertility:+An+updated+review.">Role of oxidative stress in male infertility: An updated review.</a> J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).</li><li>Schlegel, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+infertility+in+men:+AUA/ASRM+guideline+Part+I.">Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I.</a> J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).</li><li>Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+detection+in+human+semen+using+flow+cytometry.">Leukocyte detection in human semen using flow cytometry.</a> Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).</li><li>Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+guidelines+for+the+evaluation+and+treatment+of+leukocytospermia+in+male+infertility.">Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility.</a> World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+as+an+active+disease+biomarker:+recent+biochemical+and+pathological+perspectives.">Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives.</a> Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).</li><li>Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+pathological+studies+on+peroxidases+-an+updated+review).">Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review).</a> Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+hypochlorous+acid+promotes+ox-LDL-induced+senescence+of+endothelial+cells+through+a+mechanism+involving+beta-catenin+signaling+in+hyperlipidemia.">Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia.</a> Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).</li><li>Nicholls, S. J., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+and+cardiovascular+disease.">Myeloperoxidase and cardiovascular disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).</li><li>Wolff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biologic+significance+of+white+blood+cells+in+semen.">The biologic significance of white blood cells in semen.</a> Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).</li><li>Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+enhances+neutrophil+elastase+release+through+activation+of+P2+and+A3+receptors.">Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).</li><li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+destruction+by+neutrophils.">Tissue destruction by neutrophils.</a> N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אורתו-טולוידין ומי חמצן הם בעלי תכונות רגישות לאור ויכולים להתפרק כאשר הם נחשפים לאור. כדי להבטיח את האפקטיביות של ריאגנטים הבדיקה, מומלץ לאחסן את נוזל העבודה מוכן במקום חשוך. 
דגימות זרע מציגות באופן טבעי מאפיינים הטרוגניים. בתהליך ההכנה של דגימות זרע, שיפוט נכון של מצב ההנ...

אי פוריות התפתחה כבעיה עולמית של בריאות הציבור המשפיעה על כ -15% מהזוגות בגיל הפוריות שלהם. גורמים גבריים נתרמים על ידי כ -50% מכלל מקרי תת-פוריות, וכמעט 20% עד 30% ניתן לייחס אך ורק לגורמים גבריים 1,2,3. זיהומים בדרכי המין הגבריים (MGTIs) מהווים את אחד הגורמים המשמעותיים לאי פוריות הגבר, ומהווים כ -15% מהמקרים 4,5.
לרוב האנשים יש לויקוציטים בזרע שלהם, המהווים 13% מהתאים שאינם זרעונים, כאשר הפרופורציות השונות הן נויטרופילים 12%, מקרופאגים 0.9% ולימפוציטים 0.1%6,7. על פי מדריך המעבדה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לבדיקה ועיבוד של זרע אנושי (מהדורה 5), לויקוציטוספרמיה מוגדרת בדרך כלל כנוכחות של >1 × 106 תאים / מ"ל לויקוציטים בזרע8. מצב זה יכול להיגרם על ידי גורמים רבים כגון רעלים סביבתיים, שימוש בסמים, וריקוצלות, MGTI וכו ', כולם עלולים להוביל לעלייה חריגה בריכוז לויקוציטים בזרע9. לויקוציטים יכולים להעלות את רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בזרע, ולגרום לחמצון שומנים ולנזק חמצוני לחלבון ולדנ"א, מה שגורם לירידה בתנועתיות הזרעונים, לעלייה בהפרעות מורפולוגיות בזרעונים, לעלייה במדד פיצול הדנ"א של הזרעונים, לפגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים ואפילו להשפעות שליליות על התפתחות העובר10,11.
כיום, אנדרולוגים בדרך כלל בוחרים לבחון תאים עגולים בזרע או אלסטאז בפלסמת הזרע בעת זיהוי דלקת בדרכי המין. עם זאת, לעתים קרובות מאתגר להבחין בין תאי זרע משופשפים לבין תאי אפיתל של דרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה6. שיטת הבדיקה האחרונה מסובכת יחסית וגוזלת זמן, עם דיווח תוצאות איטי, שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון MGTIs. האגודה האורולוגית האמריקאית (AUA) מציעה כי יש לבצע התמיינות נוספת בין לויקוציטים לתאים ממערכת איברי המין כאשר ריכוז התאים העגולים בניתוח זרע גדול מ- 1 × 106 תאים / מ"ל12. מעבדות אנדרולוגיה מסוימות משתמשות בציטומטריית זרימה13 או אנטיגן לויקוציטים (למשל, CD45) אימונוציטוכימיה14 כדי לבחון לויקוציטים. בעוד שיטות אלה מדויקות, הן יקרות וגוזלות זמן, מה שמקשה על יישום קליני בקנה מידה גדול, במיוחד במדינות מתפתחות.
פרוקסידז מופץ באופן נרחב בסוגים שונים של תאים וממלא תפקיד מכריע בעמידות לנזקי עקה חמצונית. Myeloperoxidase (MPO) הוא חבר בתת-משפחת הפרוקסידז המתבטא בדרך כלל בתאי מערכת החיסון. הוא מתבטא בצורה הגבוהה ביותר בגרגירים אזורופיליים15,16 של נויטרופילים ומתבטא גם בלימפוציטים17,18, מונוציטים ומקרופאגים19. ריכוז לויקוציטים, במיוחד נויטרופילים, בזרע ניתן להשיג על ידי בחינת תאים עגולים שהם חיוביים peroxidase 7,20. כדי להפוך את תהליך הבדיקה של לויקוציטים בזרע לחסכוני, נוח ויעיל, הנדסנו מחדש את שיטת הבדיקה. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים תוך 60 דקות. שיטה חדשה זו מפחיתה את עלויות הבדיקה של המטופלים ואת זמן ההמתנה לקבלת תוצאות, מקלה על עומס העבודה של טכנאי המעבדה ומקצרת את תקופת ההמתנה לאבחון ולטיפול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% (v/v) hydrogen peroxide solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Sperm Class Analyzer &#8211; SCA SCOPE&#160;</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>1222996; Model type: SCA-SCOPE-H</td>
			<td>Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable centrifugal tube (1.5 mL)</td>
			<td>Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD</td>
			<td>2210009</td>
			<td>Centrifugal tube for Staining process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette (3 mL)</td>
			<td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td>
			<td>20221101</td>
			<td>Polymer-based pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic counter</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>A multichannel counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scales</td>
			<td>Shanghai Liangping Instrument Co., LTD</td>
			<td>D9008084</td>
			<td>MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler counting chamber</td>
			<td>Makler</td>
			<td>MQ30004</td>
			<td>0.01 sq.mm, 10 &#956;m deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>3G41067201307</td>
			<td>CX31, 10&#215;40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho-toluidine substrate solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(1 mL)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>02923205</td>
			<td>1000 tips/unit, 5 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(10 &#181;L)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>00323961</td>
			<td>1000 tips/unit, 20 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(200 &#181;L)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>32822810</td>
			<td>1000 tips/unit, 20 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCA counting chamber</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>102230608</td>
			<td>10 &#181;m, 2 Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The container for semen sample</td>
			<td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td>
			<td>20230701</td>
			<td>Polymer-based receptacle for semen sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic table</td>
			<td>Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD</td>
			<td>MQ30004</td>
			<td>MQ-300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-dimensional shaker</td>
			<td>DragonLab</td>
			<td>822000010000</td>
			<td>VC5A002205</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the examination of peroxidase-positive leukocytes in semen

לוקוציטוספרמיה יכולה להוביל לירידה בתנועתיות הזרעונים, הפרעות מורפולוגיות מוגברות בזרעונים, עלייה במדד פיצול ה- DNA של הזרעונים, פגיעה בתפקוד אקרוזום הזרעונים, ואפילו התפתחות עוברית מושפעת. זוהי מחלה אנדרולוגית נפוצה בפרקטיקה הקלינית ואחד הגורמים החשובים לאי פוריות הגבר. כאשר קובעים אם קיימת דלקת בדרכי הרבייה הגברית, אנדרולוגים בוחרים לעתים קרובות לבחון תאים עגולים או אלסטאז פלזמה זרע בזרע כבסיס אבחוני קליני. עם זאת, בדיקת תאים עגולים מושפעת בקלות מתאי זרע מושחתים ותאי אפיתל בדרכי הרבייה, שאינם תורמים להפחתת השימוש חסר ההבחנה והמיותר באנטיביוטיקה. יחד עם זאת, תהליך הגילוי של אלסטאז הוא מסובך יחסית, גוזל זמן ואיטי בדיווח על תוצאות, מה שאינו מועיל לאבחון מוקדם וטיפול במחלות כגון דלקות בדרכי המין הגבריות (MGTI). יישמנו באופן חדשני את הבדיקה של לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע בסיוע מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) כקריטריון אבחון עבור לויקוציטוספרמיה, ופתרנו בהצלחה בעיות אלה. בדיקה זו דורשת רק תוספת של נוזל הפעולה המורכב מארבעה ריאגנטים לתוך הדגימה, ואת זמן התגובה הכולל בטמפרטורת החדר ניתן לשלוט בתוך 20-30 דקות. עם כתם הבא בדיקה מיקרוסקופית, ריכוז של לויקוציטים חיוביים peroxidase בזרע ניתן להשיג בתוך סך של 60 דקות, אשר ניתן להשתמש בו כדי לאבחן אם דלקת של מערכת הרבייה הגברית קיים.

Infertility has emerged as a global public health issue affecting approximately 15% of couples in their reproductive age. Male factors are contributed by around 50% of total subfertility cases, and nearly 20% to 30% can be attributed solely to male factors1,2,3. Male genital tract infections (MGTIs) constitute one of the significant causes of male infertility, accounting for about 15% of cases4,5.
Most individuals have leukocytes in their semen, constituting 13% of non-spermatozoan cells, with differential proportions being neutrophils 12%, macrophages 0.9%, and lymphocytes 0.1%6,7. According to the World Health Organization (WHO) laboratory manual for the examination and processing of human semen (5th ed.), leukocytospermia is usually defined as the presence of &#62;1 &#215; 106 cells/mL leucocytes in semen8. This condition can be caused by numerous factors such as environmental toxins, substance abuse, varicoceles, MGTIs, etc., all potentially leading to an abnormal increase in leukocyte concentration in semen9. Leukocytes can elevate reactive oxygen species (ROS) levels in semen, causing lipid peroxidation and oxidative damage to protein and DNA, which results in decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation index, impairment of the spermatozoa acrosome function, and even negative impacts on embryo development10,11.
Currently, andrologists commonly choose to examine round cells in semen or elastase in seminal plasma when identifying genital tract inflammation. However, it&#39;s often challenging to distinguish sloughed spermatogenic cells and reproductive tract epithelial cells, which do not contribute to reducing the indiscriminate and unnecessary use of antibiotics6. The latter examination method is relatively complicated and time-consuming, with slow result reporting, which is not beneficial for early diagnosis and treatment of diseases such as MGTIs. The American Urological Association (AUA) suggests further differentiation between leukocytes and sloughed cells from the genital tract should be made when the round cell concentration in semen analysis is greater than 1 &#215; 106 cells/mL12. Some andrology labs utilize flow cytometry13 or leukocyte antigen (e.g., CD45) immunocytochemistry14 to examine leukocytes. While these methods are precise, they are expensive and time-consuming, making large-scale clinical implementation difficult, especially in developing countries.
Peroxidase is widely distributed in various types of cells and plays a crucial role in the resistance to oxidative stress damage. Myeloperoxidase (MPO) is a member of the peroxidase subfamily that is generally expressed in immune cells. It is most highly expressed in neutrophils&#39; azurophilic granules15,16 and is also expressed in lymphocytes17,18, monocytes, and macrophages19. The concentration of leukocytes, especially neutrophils, in semen can be obtained by examining round cells that are peroxidase-positive7,20. To make the examination process of leukocytes in semen economical, convenient, and efficient, we reengineered the examination method. Assisted by the computer-assisted semen analysis (CASA) system, the concentration of leukocytes can be obtained within 60 min. This new method reduces the patients&#39; examination costs and waiting time for obtaining results, alleviates the workload of lab technicians, and shortens the doctor&#39;s diagnosis and treatment waiting period.

מחבר זרקור: שיטה פשוטה וחסכונית לניתוח לויקוציטים בזרע 

בדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע

Male reproductive medicine is my primary research focus, and our protocol primarily addresses the issues of speed and cost in analyzing peroxidase-positive leukocytes in semen. Semen is inherently heterogeneous, which greatly affects the stability of semen analysis results. Therefore, it is essential to ensure that semen is liquified and thoroughly mixed before examination.Our protocol combines manual and automatic methods to calculate the concentration of leukocytes by utilizing sperm concentration, which saves time and is more cost-effective compared to the ready counting leukocytes.

בעת יישום ההליך שהוזכר לעיל, המגיב בצינור הצנטריפוגה מפגין לעתים קרובות מראה תת-שקוף ואטום, (איור 1). זיהוי צבע חום ברור חושף degranulation פוטנציאלי של לויקוציטים, אשר עלול לגרום כתמים נוזליים. כתוצאה מכך, תהליך הצביעה עלול להיכשל, ולכן יש צורך להכתים מחדש או לאסוף דגימת זרע חדשה ל...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Cost-Effective Method for Leukocyte Analysis in Semen at JoVE.com

מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני ויעיל לבדיקת לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. בעזרת מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA), ניתן להשיג את ריכוז הלויקוציטים החיוביים לפרוקסידז בזרע תוך 60 דקות בסך הכל, ובכך לשפר ביעילות את היעילות של מעבדה אנדרולוגית ואנדרולוגים.

Leukocytospermia can lead to decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation ...

רפואת הרבייה הגברית היא מוקד המחקר העיקרי שלי, והפרוטוקול שלנו מתייחס בעיקר לסוגיות של מהירות ועלות בניתוח לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. זרע הוא הטרוגני מטבעו, מה שמשפיע מאוד על יציבות תוצאות ניתוח הזרע. לכן, חיוני לוודא כי הזרע הוא נוזלי מעורבב היטב לפני הבדיקה.הפרוטוקול שלנו משלב שיטות ידניות ואוטומטיות לחישוב ריכוז לויקוציטים על ידי ניצול ריכוז הזרע, החוסך זמן וחסכוני יותר בהשוואה לויקוציטים בספירה המוכנה.

the-examination-of-peroxidase-positive-leukocytes-in-semen

Research

JoVE Journal

Medicine

The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen

2.9K Views.  The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. רפואת הרבייה הגברית היא מוקד המחקר העיקרי שלי, והפרוטוקול שלנו מתייחס בעיקר לסוגיות של מהירות ועלות בניתוח לויקוציטים חיוביים לפרוקסידז בזרע. זרע הוא הטרוגני מטבעו, מה שמשפיע מאוד על יציבות תוצאות ניתוח הזרע. לכן, חיוני לוודא כי הזרע הוא נוזלי מעורבב היטב לפני הבדיקה.ה?...

Video: מחבר זרקור: שיטה פשוטה וחסכונית לניתוח לויקוציטים בזרע 

Leukocytospermia can lead to decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation index, impairment of the spermatozoa acrosome function, and even affected embryonic development. It is a common andrological disease in clinical practice and one of the important causes of male infertility. When determining whether male reproductive tract inflammation exists, andrologists often choose to examine round cells or seminal plasma elastase in the semen as a clinical diagnostic basis. However, the examination of round cells is easily influenced by sloughed spermatogenic cells and reproductive tract epithelial cells, which do not contribute to reducing the indiscriminate and unnecessary use of antibiotics. At the same time, the detection process of elastase is relatively complicated, time-consuming, and slow in reporting results, which is not beneficial for early diagnosis and treatment of diseases such as male genital tract infections (MGTIs). We have innovatively applied the examination of peroxidase-positive leukocytes in semen assisted by a computer-assisted semen analysis (CASA) system as a diagnostic criterion for leukocytospermia, successfully solving these problems. This examination only requires the addition of the operating fluid consisting of four reagents into the specimen, and the total reaction time at room temperature can be controlled within 20-30 min. With the subsequent smear and microscopic examination, the concentration of peroxidase-positive leukocytes in semen can be obtained within a total of 60 min, which can be used to diagnose whether the inflammation of the male reproductive tract existed.

This paper presents an economical and efficient protocol for examining peroxidase-positive leukocytes in semen. With the assistance of a computer-assisted semen analysis (CASA) system, the concentration of peroxidase-positive leukocytes in semen can be obtained within a total of 60 min, effectively improving the efficiency of andrology laboratory and andrologists.