מחקר זה מומן על ידי תוכנית המפתח של קרן צ'ונגצ'ינג למדעי הטבע (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס '32270988).

הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לרווחת חיות מעבדה ואתיקה של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה.
1. הכנת ננו-תחליבים (NEs)
<ol><li>להכנת פאזה מימית, יש להמיס 0.15 גרם פוליסורבט 80 ב-28.2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) תוך ערבוב ב-40°C.</li>
	<li>להכנת שלב השמן, השתמש בנוסחת פאזת השמן של ננו-תחליב המוצג בטבלה 1. ממיסים את הטרילאט הסוריניטני 85, DOTAP ו-RA בסקוואלן תוך ערבוב ב-40°C.</li>
	<li>להכנת תחליב O/W ראשוני, ערבבו את פאזת השמן באופן מגנטי ב-1,400 סל"ד תוך הוספת המימית לאט ובטיפה בקצב של 1 מ"ל/דקה. בצעו תחליב מראש את התערובת באמצעות מתחלב גזירה גבוה ב-30,000 סל"ד למשך 6 דקות.</li>
	<li>עבור הומוגניזציה בלחץ גבוה (HPH), טפל בתחליב O/W הראשוני שהוכן לעיל עם הומוגנייזר בלחץ גבוה במשך 12 מחזורים ב- 900 בר כדי לקבל ננו-תחליב הומוגני בטווח של 160-190 ננומטר.</li>
	<li>בסוף התהליך, אספו את התחליב בבקבוק של 50 מ"ל וסננו את התחליב דרך קרום מסנן PES של 0.2 מיקרומטר.</li>
	<li>חברו את הבקבוק לקו שלנק דרך הצנתר, סובבו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לחבר את המערכת לשפופרת הוואקום והפעילו את משאבת הוואקום כדי ליצור ואקום בצלוחית. לאחר מכן, מסובבים את הסטופקוק המשולש, מחברים את המערכת לצינור ארגון וממלאים אותו בארגון. חזור על שלב זה 3 פעמים כדי לוודא שהבקבוק מלא בארגון.</li>
	<li>החלף את הפקק ואטם עם סרט paraffine, לעטוף את הבקבוק בנייר כסף ולאחסן אותו ב 4 ° C.</li>
</ol>2. אפיון הננו-אמולסיות
<ol><li>גודל חלקיקים וזיהוי פוטנציאל זטה<ol><li>הפעל את המכשיר והמתן 30 דקות עד שמקור אור הלייזר יתייצב.</li>
		<li>לדלל את NE 50-fold עם מים טהורים במיוחד ולהוסיף 1 מ"ל של דגימה לתא הדגימה המתאים.</li>
		<li>כדי למדוד את גודל החלקיקים, כוונו את הטמפרטורה ל-25°C, בחרו מים כמדיום לפיזור ובחרו כלי פלסטיק חד-פעמיים כתא המדידה. טען את הדגימות ומדוד באופן אוטומטי. דווח על הערך הממוצע של שלוש מדידות חוזרות עבור כל דגימה כתוצאה הסופית.</li>
		<li>למדידת פוטנציאל זטה, הגדר את הטמפרטורה ל -25 מעלות צלזיוס. בשל הבחירה בפאזה המימית כמדיום הפיזור, בחר במודל סמולוצ'וסי, ובתא הנימי המקופל כתא המדידה. טען את הדגימות ומדוד באופן אוטומטי. דווח על הממוצע של שלוש מדידות משוכפלות עבור כל דגימה כתוצאה הסופית.</li>
	</ol></li>
	<li>קביעת קצב אנקפסולציה וקצב העמסת תרופות<ol><li>כדי לקבוע את כמות RA טעון NE, להשתמש אתנול מוחלט כדי demulsify ולחלץ את RA מן NE. כדי 5 μL של דגימה, להוסיף 995 μL של אתנול ולקבוע את התוכן RA של הפתרון באמצעות ספקטרופוטומטר ב 355 ננומטר. השווה את הספיגה לעקומה סטנדרטית. השתמש במשוואה הבאה: אנקפסולציה = עומס RA בפועל / משקל של תרופה נוספת קצב העמסת תרופות = העמסת RA בפועל / איכות הדגימה</li>
	</ol></li>
</ol>3. נהלי חיסון ואיסוף דגימות
<ol><li>הליך החיסון והקיבוץ<ol><li>נקבות קבוצת עכברי Balb/C בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל של כ-18-21 גרם בקבוצות של 5 לחיסון ביום 0, יום 14, יום 28 על פי קבוצות הניסוי הבאות: (1) קבוצת PBS, (2) קבוצת אובאלבומין (OVA), (3) קבוצת OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) קבוצת OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).</li>
		<li>חסן את כל העכברים על ידי הזרקה תוך שרירית לשרירי הארבע ראשי העליונים עם 200 μL של נוסחאות חיסון שונות: 100 μL של תחליב ו 15 מיקרוגרם OVA נספג ב 100 μL של PBS, מעורבב לפני מתן המוצר. יש להזריק 100 μL/רגל אחורית. עבור עכברים בקבוצת הביקורת לנהל PBS לבד.</li>
		<li>המתת חסד: המתת חסד של כל העכברים על ידי זריקה תוך צפקית של 100 מ"ג / ק"ג של 1% נתרן pentobarbital 2 שבועות לאחר השלמת שלושת החיסונים.</li>
		<li>איסוף דגימות ועיבוד: לאחר המתת חסד, השתמש מספריים כדי לחתוך את החזה של עכברים ולהכניס מזרק ישירות לתוך הלב כדי לשאוף כ 0.5 מ"ל של דם שלם. אפשר את הדם לעמוד במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). יש לאסוף סרום, aliquot ולאחסן ב -80 °C לניתוח נוסף.</li>
		<li>יש לאסוף דם מלא, טחול, נוזל שטיפת נרתיק (VLF), נוזל שטיפה סימפונות (BALF), נוזל שטיפת אף (NLF) ונוזל שטיפת מעי דק (SILF).</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד של לימפוציטים טחול<ol><li>משרים עכברים באתנול 75% (v/v) לעיקור קצר, מעבירים את העכברים לספסל נקי. לחתוך את העור על הבטן השמאלית עם מספריים, לחשוף ולהסיר את הטחול.</li>
		<li>מניחים את הטחול בצלחת פטרי המכילה 3 מ"ל PBS, טוחנים ומסננים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל באמצעות מסננת (200 רשת, 70 מיקרומטר) ומוט השחזה.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את supernatant ולהשעות את המשקע עם 3 מ"ל של תמיסת ליזה של תאי דם אדומים, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של PBS לצינור ולנער היטב כדי לסיים את התגובה, ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-10 מ"ל PBS, הוסיפו 20 מיקרוליטר של דילול התא למונה התאים האוטומטי לצורך ספירת תאים.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 650 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולדלל את התאים ל-1 x 106 תאים/מ"ל עם 1640 תווך מלא (1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% נסיוב בקר עוברי).</li>
	</ol></li>
	<li>אוסף VLF: יש לשטוף את הנרתיק 4x עם 75 μL של 1% BSA/PBST, לשלב את תמיסת השטיפה ולאסוף בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב 5000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות ולאסוף את supernatant עם פיפטה ולאחסן ב -80 ° C.</li>
	<li>אוסף BALF ו-NLF<ol><li>יש לחטא את העכברים לאחר ההקרבה באתנול 75% (v/v). החזק את בטן העכבר למעלה ויישר את הצוואר. השתמש מספריים כדי לבצע חתך אורכי בעור של צוואר העכבר ולהשתמש מלקחיים כדי להפריד את השרירים לחשוף את קנה הנשימה כראוי.</li>
		<li>חותכים את קנה הנשימה דרך פתח רוחבי קטן ומכניסים את הצינור לכיוון הריאות, מחברים את המזרק לצינור ומזריקים 0.5 מ"ל PBS לריאות ונסוגים, חוזרים על שטיפה 3x וצנטריפוגה ב 650 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות, לאחסן את supernatant (BALF) ב -80 ° C.</li>
		<li>הפוך את הצינור לחלל האף, חבר את המזרק לצינור והזריק 0.5 מ"ל של PBS, הנוזל יזרום דרך חלל האף לתוך צינור הצנטריפוגה 1.5 מ"ל. שאפו את השטיפה מצינור הצנטריפוגה וחזרו על השטיפה 2x, לאחר מכן צנטריפוגה ב 650 x גרם ב 4 °C במשך 5 דקות, לאחסן את supernatant (NLF) ב -80 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>אוסף SILF<ol><li>הכינו תמיסת PBS המכילה מעכב טריפסין 0.1 מ"ג/מ"ל, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/L פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) כתמיסת שטיפת המעי הדק. יש לערבב בטמפרטורת החדר עד להתמוססות ולאחסן ב-4°C.</li>
		<li>חותכים את המעי הדק לפתוח לאורך צינור המעי לטבול 3 מ"ל של נוזל שטיפה במעי הדק. יש לערבב על ידי ניעור אנכי ב-15 סל"ד למשך 30 דקות ב-4°C. צנטריפוגה ב 1440 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות ולאסוף את supernatant עם פיפטה, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 5000 x גרם ב 4 ° C במשך 20 דקות. אחסנו את הסופרנאטנט (SILF) בטמפרטורה של -80°C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הערכה של תגובת נוגדנים ספציפית ל- OVA לאחר מתן תוך שרירי
<ol><li>לקבוע רמות של IgG בסרום, תת-מחלקות של IgG1, IgG2a ואת רמות sIgA ספציפיות ב- VLF, BALF, NLF ו- SILF על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA).</li>
	<li>לציפוי אנטיגן, יש לדלל את OVA ל-5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות חיץ ציפוי, ולצפות צלחות ELISA של 96 בארות למשך הלילה ב-4°C עם 100 מיקרוליטר של תמיסת OVA לכל באר.</li>
	<li>יש לשטוף את צלחות ELISA 5x עם PBST ולחסום על ידי דגירה עם 250 μL של 1% BSA/PBST ב-37°C למשך שעתיים.</li>
	<li>יש לשטוף את צלחות ELISA 5x עם PBST, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של הדגימה מדולל כמתואר להלן כדי להיבדק ולדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. סרום מדולל, VLF, BALF, NLF עם 0.5% BSA/PBST, סילף מדולל עם 20% סרום עגל עוברי (FCS)/PBST.<ol><li>התחל על ידי דילול הסרום 1000x באמצעות הליך דילול דו-שלבי: לדלל 20 μL של סרום ל 1 מ"ל, ולאחר מכן לדלל 25 μL של סרום מדולל זה ל 500 μL. השתמש בדילול זה של סרום לזיהוי של IgG1, IgG2a.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 200 μL של הסרום מדולל ב 1000x לשורה הראשונה של הצלחת המצופה ולהוסיף 100 μL של 0.5% BSA/PBST לכל הבארות למעט השורה הראשונה. מעבירים 100 μL מהשורה הראשונה לשורה השנייה ומערבבים 10x עם הפיפטה. חזור על שלב זה עד שורה 8 ולהשליך 100 μL של נוזל, הסרום של ריכוזים שונים התקבל לזיהוי של IgG.</li>
	<li>בצע דילול 1:1 של BALF, NLF ו- SILF כדי לזהות IgA. השתמש באותו הליך דילול עבור VLF כמו זה עבור סרום.</li>
	<li>שטפו את צלחות ELISA 5x עם PBST. הוסף 100 μL של עז מצומדת HRP נגד עכבר IgG/IgG1/IgG2a/IgA (מדולל 1:10000 עם PBST) לבארות המתאימות ודגור ב 37 ° C במשך 40 דקות.</li>
	<li>שטפו את צלחות ELISA 5x עם PBST, הוסיפו 100 μL של מצע TMB ELISA (רגיש במיוחד), והעבירו את הצלחת למקום מוגן מאור למשך 5 דקות. הוסף מיד 100 μL של תמיסת עצירה של 450 ננומטר עבור מצע TMB כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>מדוד את הספיגה (OD) ב- 450 ננומטר עבור כל באר וחשב את טיטר הנוגדנים על ידי לקיחת פי 2.1 מערך הסרום של עכבר הקבוצה הריקה כערך התגובה החיובית.</li>
</ol>5. בדיקת ELISpot
<ol><li>עקוב אחר ההנחיות עבור ELISpot Plus, השתמש בעכבר IFN-γ (ALP) מהערכה כדי לבצע את הבדיקות.</li>
	<li>מוציאים את הצלחת מהאריזה האטומה ושוטפים 4x עם PBS סטרילי (200 מיקרוליטר/באר). מזננים את הצלחת ב-1640 מדיום שלם (200 מיקרוליטר/באר) ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הסר את המדיום והוסף את הריכוז המותאם של תרחיף לימפוציטים שהוכן בשלב 3.2.2 (100 μL / באר) לצלחת, ולאחר מכן הוסף 100 μL של הגירוי כלומר, 1640 מדיום שלם המכיל 20 מיקרוגרם / מ"ל OVA257 ~ 264 או OVA323 ~ 339 או 1640 מדיום שלם. מניחים את הצלחת באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות. עטפו את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי.</li>
	<li>השליכו את מתלה התא ושטפו את הצלחת 5x עם PBS (200 μL/well). יש לדלל את נוגדן הזיהוי (R4-6A2-ביוטין) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS המכיל 0.5% סרום עגל עובר (PBS-0.5% FCS). מוסיפים 100 μL/באר ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את הצלחת כמו בשלב 5.2. לדלל את streptavidin-ALP (1:1000) ב PBS-0.5% FCS ולהוסיף 100 μL / באר, לדגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את הצלחת כמו בשלב 5.2. סנן את פתרון המצע המוכן לשימוש (BCIP/NBT-plus) דרך מסנן 0.45 מיקרומטר והוסף 100 מיקרוליטר/באר. יש לפתח עד להופעת נקודות ברורות.</li>
	<li>עצרו את התפתחות הצבע על ידי שטיפה נרחבת במי ברז, הסירו את הפלסטיק הרך והשאירו את הצלחת לייבוש.</li>
	<li>בדוק וספור כתמים בקורא ELISpot.</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>נתח את ההבדלים בין נתונים של 4 קבוצות על ידי ANOVA חד כיווני ואחריו Tukey השוואה מרובים לאחר המבחן. בטא את כל התוצאות כממוצע ± SD. ערך P קטן מ- 0.05 נחשב למשמעותי.</li>
</ol>

הערכת אימונוגניות של חומצה רטינואית עטופה בננו-תחליב בעכברים

<ol>
	<li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants.">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+and+cancer+immunotherapy+efficacy+of+a+squalane-in-water+delivery+system+emulsified+by+bioresorbable+poly(ethylene+glycol)-block-polylactide.">Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide.</a> Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Omer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+vaccines+work.">Why and how vaccines work.</a> Cell. 183 (2), 290-295 (2020).</li><li>Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+protection+mediated+by+cooperation+between+vascular+and+epithelial+barriers.">Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers.</a> Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> J Cont Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+adjuvant+activity+of+cationic+liposome:+Phosphorylation+of+a+MAP+kinase,+ERK+and+induction+of+chemokines.">Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines.</a> Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).</li><li>Korsholm, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+mechanism+of+cationic+dimethyldioctadecylammonium+liposomes.">The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes.</a> Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).</li><li>Agger, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+formulated+with+synthetic+mycobacterial+cordfactor+(CAF01):+A+versatile+ddjuvant+for+vaccines+with+different+immunological+requirements.">Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements.</a> Plos One. 3 (9), e3116 (2008).</li><li>Slutter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+vaccination+with+N-trimethyl+chitosan+and+PLGA+based+nanoparticles:+Nanoparticle+characteristics+determine+quality+and+strength+of+the+antibody+response+in+mice+against+the+encapsulated+antigen.">Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen.</a> Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).</li><li>Nochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogel+antigenic+protein-delivery+system+for+adjuvant-free+intranasal+vaccines.">Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines.</a> Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).</li><li>Henriksen-Lacey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+cationic+charge+and+antigen+adsorption+are+important+properties+for+the+efficient+deposition+of+antigen+at+the+injection+site+and+ability+of+the+vaccine+to+induce+a+CMI+response.">Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.</a> J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).</li><li>Zhong, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovaccines+mediated+subcutis-to-intestine+cascade+for+improved+protection+against+intestinal+infections.">Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections.</a> Small. 18 (1), e2105530 (2022).</li><li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gut-homing+IgA-secreting+B+cells+by+intestinal+dendritic+cells.">Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells.</a> Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li><li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+homing+of+protective+T+and+B+cells+to+the+gut+after+subcutaneous+immunization+in+mice.">Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).</li><li>Burger, C., Shahzad, Y., Br&#252;mmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traversing+the+skin+barrier+with+nano-emulsions.">Traversing the skin barrier with nano-emulsions.</a> Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).</li><li>Lodaya, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+design,+optimization+and+evaluations+of+an+&#945;-tocopherol-containing+self-emulsified+adjuvant+system+using+inactivated+influenza+vaccine.">Formulation design, optimization and evaluations of an &#945;-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine.</a> J Cont Release. 316, 12-21 (2019).</li><li>Carmona-Ribeiro, A. M., P&#233;rez-Betancourt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+nanostructures+for+vaccines+design.">Cationic nanostructures for vaccines design.</a> Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).</li><li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications.">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).</li><li>Nie, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+approach+to+overcome+mucosal+entrapment+of+DNA+nanoparticles+for+oral+gene+delivery+of+glucagon-like+peptide+1.">Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1.</a> Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).</li><li>Lou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+self-amplifying+mRNA+vaccines+by+cationic+lipid+nanoparticles:+The+impact+of+cationic+lipid+selection.">Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection.</a> J Cont Release. 325, 370-379 (2020).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים בעבודה זו.

בפרוטוקול זה, פיתחנו חומצה רטינואית קטיונית בעטוף ננו-תחליב שתשמש כאדג'ובנט לקידום תגובות מערכתיות וריריות ספציפיות לאנטיגן. בהשוואה לאדג'ובנטים NE מסורתיים, יש לו את שני היתרונות הבאים. ראשית, באופן כללי, פני השטח של O/W NEs יש מטען שלילי גבוה, מה שמקשה על טעינה ישירה של אנטיגנים. NEs קטיוניים י?...

אדג'ובנטים משמשים לעתים קרובות כדי לשפר את היעילות של חיסון על ידי גירוי המערכת החיסונית להגיב חזק יותר לחיסון, ובכך להגדיל את החסינות לפתוגן מסוים1. ננו-תחליב (NE) אדג'ובנט מתייחס למערכת פיזור קולואידית עם יציבות תרמודינמית על ידי תחליב חלק מסוים של פאזת שמן ופאזה מימית כדי לייצר תחליב בצורה של מים בשמן (W/O) או שמן במים (O/W)2. אדג'ובנט ננו-תחליב O/W יכול לייצר ציטוקינים וכימוקינים באתר ההזרקה, לגרום לצבירה מהירה ולשגשוג של תאים חיסוניים חשובים כגון מונוציטים, נויטרופילים ואאוזינופילים, לשפר את התגובה החיסונית, ולשפר את האימונוגניות של אנטיגנים3. נכון לעכשיו, שלושה אדג'ובנטים של ננו-תחליב (MF59, AS03 ו-AF03) קיבלו רישיון לשימוש בחיסונים והראו בטיחות ויעילות טובות4.
עם זאת, חסינות הרירית טופלה בצורה גרועה על ידי פורמולציות האדג'ובנטיות המורשות כיום בחיסון פרנטרלי קונבנציונאלי5. דווח כי חומצה רטינואית (RA) גורמת לביות מעיים של תאי מערכת החיסון, אך הקוטביות הנמוכה שלה, המסיסות הירודה שלה במים, האור החלש והיציבות התרמית שלה מגבילים את השימוש בה לחיסון אנטרי חזק. ננו-תחליבים מציעים הזדמנויות להגדיל את הזמינות הביולוגית של תרופות ליפופיליות מאוד, וליבת השמן של אדג'ובנטים של תחליב O/W מתאימה להמסת חומרים לא קוטביים כגון RA6. לכן, ננו-תחליבים יכולים לשמש כנשאים עבור RA על מנת להשיג את אפקט התגובה הכפולה של חסינות מערכתית וחסינות רירית.
בהשוואה למערכות משלוח ניטרליות או אניוניות, למערכות משלוח קטיוניות יש יכולות אנקפסולציה ומסירה יעילות יחסית של אנטיגן, שיכולות לשפר את האימונוגניות של אנטיגנים 7,8,9. מטען פני השטח הקטיוני של מגוון מערכות אדג'ובנטיות חשוב להשפעתן האדג'ובנטית 10,11,12. המטען הקטיוני הוא גורם חשוב בהארכת שימור החיסון באתר ההזרקה, הגברת הצגת האנטיגן והארכת גירוי החסינות התאית בגוף12.
בהתבסס על השיקולים לעיל, פיתחנו ננו-תחליב קטיוני כדי לספק ביעילות RA ואנטיגנים. גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של הננו-תחליב נקבעו באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), והתגובות החיסוניות המערכתיות והריריות של ננו-תחליב בשילוב עם OVA הוערכו על ידי הזרקה תוך שרירית13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

ננו-מבנים קטיוניים התפתחו כמערכת אספקת אדג'ובנט ואנטיגן המשפרת את הבשלת התאים הדנדריטיים, יצירת ROS וספיגת אנטיגן ולאחר מכן מקדמת תגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן. בשנים האחרונות, חומצה רטינואית (RA) זוכה לתשומת לב גוברת בשל השפעתה בהפעלת התגובה החיסונית הרירית; עם זאת, על מנת להשתמש RA כמו adjuvant רירית, יש צורך לפתור את הבעיה של פירוק שלה, העמסה, ומשלוח. במאמר זה אנו מתארים מערכת אספקה קטיונית של חומצה רטינואית בעטוף תחליב ננו-תחליב (CNE-RA) המורכבת מהשומנים הקטיוניים 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), חומצה רטינואית, סקוואלן כשלב השמן, פוליסורבט 80 כחומר פעילי שטח, וסורביטן טריאולאט 85 כקו-פעילי שטח. תכונותיו הפיזיקליות והכימיות אופיינו באמצעות פיזור אור דינמי וספקטרופוטומטר. חיסון עכברים בתערובת של אנטיגן (אובלבומין, OVA) ו- CNE-RA העלה באופן משמעותי את רמות האימונוגלובולין A (sIgA) המפריש אנטי-OVA בנוזל שטיפת הנרתיק ובנוזל שטיפת המעי הדק של עכברים בהשוואה ל- OVA בלבד. פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה, אפיון והערכה של ההשפעה האדג'ובנטית של CNE-RA.

Adjuvants are often used to enhance the efficacy of a vaccine by stimulating the immune system to respond more strongly to the vaccine, thereby increasing immunity to a particular pathogen1. Nanoemulsion (NE) adjuvant refers to a colloidal dispersion system with thermodynamic stability by emulsifying a certain proportion of oil phase and aqueous phase to produce an emulsion in the form of water-in-oil (W/O) or oil-in-water (O/W)2. O/W nanoemulsion adjuvant can produce cytokines and chemokines at the injection site, induce the rapid aggregation and proliferation of important immune cells such as monocytes, neutrophils, and eosinophils, and enhance the immune response, and improve the immunogenicity of antigens3. Currently, three nanoemulsion adjuvants (MF59, AS03, and AF03) have been licensed for use in vaccines and have shown good safety and efficacy4.
However, mucosal immunity has been poorly addressed by the currently licensed adjuvant formulations in conventional parenteral vaccination5. Retinoic acid (RA) has been reported to induce intestinal homing of immune cells, but its low polarity, poor solubility in water, and poor light and thermal stability limit its use for robust enteric vaccination. Nanoemulsions offer opportunities to increase the bioavailability of highly lipophilic drugs, and the oil core of O/W emulsion adjuvants is suitable for dissolving non-polar substances such as RA6. Therefore, nanoemulsions can be used as carriers for RA in order to achieve the dual response effect of systemic immunity and mucosal immunity.
Compared to neutral or anionic delivery systems, cationic delivery systems have relatively efficient antigen encapsulation and delivery capabilities, which can enhance the immunogenicity of antigens7,8,9. The cationic surface charge of a variety of adjuvant systems is important for their adjuvant effects10,11,12. The cationic charge is an important factor in prolonging vaccine retention at the injection site, increasing antigen presentation and prolonging the stimulation of cellular immunity in the body12.
Based on the above considerations, we developed a cationic nanoemulsion to effectively co-deliver RA and antigens. The particle size and zeta potential of the nanoemulsion were determined using dynamic light scattering (DLS), and the systemic and mucosal immune responses of the nanoemulsion combined with OVA were evaluated by intramuscular injection13.

זרקור המחבר: פיתוח והערכה של מערכת חומצה רטינואית קטיוני בעטוף ננו-תחליב לחיסון רירית

חומצה רטינואית קטיונית בעטוף ננו-תחליב כאדג'ובנט לקידום תגובות מערכתיות וריריות ספציפיות ל-OVA

We are working on a mucosal vaccine that produces an immune response as the set of infection, which has the potential to prevent infection and interrupt transmission. We have developed a catatonic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid delivery system immunization with ovalbumin by intramuscular injection, which triggers both systemic and mucosal immune responses. In future studies, animal models of intestinal-related diseases can be used to further evaluate the effect and the mechanism of a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid in enhancing vaccine protection.

בסך הכל הוכנו ארבע פורמולציות ננו-תחליב שאופיינו על-ידי גודל החלקיקים שלהן (איור 1), פוטנציאל הזטה שלהן ויעילות האנקפסולציה שלהן כפי שמוצג בטבלה 2. גודל החלקיקים היה מרוכז סביב 160-190nm והתוספת של DOTAP הפכה את פוטנציאל Zeta של ננו-תחליב. IgG בסרום ספציפי ל-OVA ותת-הקבוצה שלו ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development and Evaluation of a Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid System for Mucosal Vaccination at JoVE.com

בפרוטוקול זה, פיתחנו חומצה רטינואית קטיונית בעטוף תחליב ננו-תחליב (RA) שתשמש כאדג'ובנט לקידום תגובות מערכתיות וריריות ספציפיות לאנטיגן. על ידי הוספת RA שאושר על ידי ה- FDA לננו-תחליב, sIgA ספציפי לאנטיגן קודם בנרתיק ובמעי הדק לאחר הזרקה תוך שרירית של ננו-תחליב.

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

אנחנו עובדים על חיסון רירית שמייצר תגובה חיסונית כקבוצת זיהום, שיש לו פוטנציאל למנוע הדבקה ולהפריע להעברה. פיתחנו מערכת העברת חומצה רטינואית במעטפת ננו-תחליב קטטוני עם אובלבומין על ידי הזרקה תוך שרירית, המפעילה תגובות חיסוניות מערכתיות וריריות כאחד. במחקרים עתידיים, מודלים של בעלי חיים של מחלות הקשורות למעיים יכולים לשמש כדי להעריך עוד יותר את ההשפעה ואת המנגנון של חומצה רטינואית קטיוני עטוף תחליב בשיפור ההגנה מפני חיסונים.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

397 Views.  Third Military Medical University. אנחנו עובדים על חיסון רירית שמייצר תגובה חיסונית כקבוצת זיהום, שיש לו פוטנציאל למנוע הדבקה ולהפריע להעברה. פיתחנו מערכת העברת חומצה רטינואית במעטפת ננו-תחליב קטטוני עם אובלבומין על ידי הזרקה תוך שרירית, המפעילה תגובות חיסוניות מערכתיות וריריות כאחד. במחקרים עתידיים, מודל?...

Video: זרקור המחבר: פיתוח והערכה של מערכת חומצה רטינואית קטיוני בעטוף ננו-תחליב לחיסון רירית

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen uptake and then promotes antigen-specific immune responses. In recent years, retinoic acid (RA) has received increasing attention due to its effect in activating the mucosal immune response; however, in order to use RA as a mucosal adjuvant, it is necessary to solve the problem of its dissolution, loading, and delivery. Here, we describe a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (CNE-RA) delivery system composed of the cationic lipid 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), retinoic acid, squalene as the oil phase, polysorbate 80 as surfactant, and sorbitan trioleate 85 as co-surfactant. Its physical and chemical properties were characterized using dynamic light scattering and a spectrophotometer. Immunization of mice with the mixture of antigen (ovalbumin, OVA) and CNE-RA significantly elevated the levels of anti-OVA secretory immunoglobulin A (sIgA) in vaginal lavage fluid and the small intestinal lavage fluid of mice compared with OVA alone. This protocol describes a detailed method for the preparation, characterization, and evaluation of the adjuvant effect of CNE-RA.

In this protocol, we developed a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (RA) to be used as an adjuvant to promote antigen-specific systemic and mucosal responses. By adding the FDA-approved RA to the nanoemulsion, antigen-specific sIgA was promoted in the vagina and small intestine after intramuscular injection of the nanoemulsion.