התמיכה במחברים כוללת את המחלקה לרפואת ילדים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, פרס הוועד המנהל למימון תמיכה זמנית במחקר (ISF) לשנת 2022A009041, מענק המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות R21AI146405, והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות מענק תזונה במרכז המחקר להשמנת יתר בהרווארד (NORCH) 2P30DK040561-26. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

פרוטוקולים לניתוח זיהום שיגלה בתאי אפיתל המעי הגס

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שלוש בדיקות סטנדרטיות לחקר היצמדות לשיגלה, פלישה ושכפול תוך-תאי של תאי אפיתל במעי. למרות ששיטות אלה הן בסך הכל גרסאות מותאמות של מבחני גנטמיצין קלאסיים המשמשים לחקר הפלישה והשכפול התוך-תאי של פתוגנים חיידקיים שונים בתוך תאי המאכסן49,50,51<sup clas...

מחלות שלשול הנגרמות על ידי פתוגנים חיידקיים אנטריים מהוות נטל בריאותי עולמי משמעותי. בשנת 2016, מחלות שלשול היו אחראיות ל -1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם והיו סיבת המוות הרביעית בשכיחותה בקרב ילדים מתחת לגיל חמש שנים של 1,2. הפתוגן החיידקי הגראם-שלילי, האנטרי, שיגלה, הוא הגורם הסיבתי לשיגלוזיס, גורם עיקרי למוות משלשולים ברחבי העולם3. שיגלוזיס גורם לתחלואה ותמותה משמעותית מדי שנה בילדים ממדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית 4,5, בעוד זיהומים במדינות בעלות הכנסה גבוהה קשורים להתפרצויות מעונות יום, מזון ומים 6,7,8,9. פיתוח חיסונים לא יעיל10 ועלייה בשיעורי עמידות מיקרוביאלית (AMR)11,12 סיבכו את הניהול של התפרצויות שיגלה בקנה מידה גדול. נתונים עדכניים של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן מראים כי כמעט 46% מזיהומי שיגלה בארצות הברית הפגינו עמידות לתרופות בשנת 202013,14, בעוד ארגון הבריאות העולמי הכריז על שיגלה כפתוגן בעדיפות AMR שעבורו יש צורך דחוף בטיפולים חדשים15.
זיהומי שיגלה מועברים בקלות דרך מסלול הצואה-דרך הפה עם בליעת מזון או מים מזוהמים, או באמצעות מגע ישיר עם בני אדם. שיגלה התפתחה להיות פתוגן יעיל המותאם לבני אדם, עם מינון מדבק של 10-100 חיידקים המספיקים כדי לגרום למחלה16. במהלך מעבר במעי הדק, שיגלה חשופה לאותות סביבתיים, כגון טמפרטורה גבוהה ומרה17. זיהוי אותות אלה גורם לשינויי שעתוק לבטא גורמי אלימות המשפרים את יכולתם של החיידקים להדביק את המעי הגס האנושי 17,18,19. שיגלה אינה פולשת לאפיתל המעי הגס מפני השטח האפיקאליים, אלא עוברת דרך שכבת האפיתל בעקבות ספיגה לתאי מיקרופולד מיוחדים מציגי אנטיגן (תאי M) בתוך אפיתל 20,21,22 הקשור לזקיק. לאחר טרנסציטוזה, תאי שיגלה עוברים פאגוציטוזה על ידי מקרופאגים תושבים. שיגלה בורח במהירות מהפאגוזום וגורם למוות של תאי מקרופאגים, וכתוצאה מכך משחררים ציטוקינים מעודדי דלקת 5,23,24. שיגלה פולש אז לתאי אפיתל המעי הגס מהצד הבזולטרלי, ממקם את הוואקול המקרופינוציטי, ומבסס נישה משוכפלת בציטופלסמה 5,25. ציטוקינים מעודדי דלקת, במיוחד אינטרלוקין-8 (IL-8), מגייסים לויקוציטים נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים (PMNs) לאתר הזיהום, מה שמחליש צמתים הדוקים אפיתל, ומאפשר חדירה חיידקית של רירית האפיתל כדי להחמיר זיהום בזולטרלי5. PMNs להרוס את רירית אפיתל נגוע כדי להכיל את הזיהום, וכתוצאה מכך הסימפטומים האופייניים של דיזנטריה חיידקית (דמית)5. למרות שמנגנוני הפלישה והשכפול התוך-תאי אופיינו ביסודיות, מחקר חדש מדגים מושגים חדשים חשובים בזיהום שיגלה, כולל ויסות אלימות במהלך מעבר במערכת העיכול (GI)17, היצמדות19, שיפור הגישה הבזולטרלית דרך חדירות מחסום26, והובלה א-סימפטומטית בילדים הסובלים מתת-תזונה27.
היכולת של Shigella spp. לגרום למחלות שלשול מוגבלת לבני אדם ולפרימטים לא אנושיים (NHP)28. מודלים של זיהום מעיים Shigella פותחו עבור דגי זברה29, עכברים30, שרקנים31, ארנבים 21,32,33 וחזירים 34,35. עם זאת, אף אחת ממערכות מודל אלה אינה יכולה לשכפל במדויק את מאפייני המחלה שנצפו במהלך זיהום אנושי36. למרות שמודלים NHP של שיגלוזיס הוקמו כדי לחקור את הפתוגנזה של שיגלה, מערכות מודל אלה יקרות ליישום ודורשות מינונים זיהומיים גבוהים באופן מלאכותי, עד תשעה סדרי גודל גבוהים יותר מהמינון המדבק של בני אדם 37,38,39,40,41,42. לפיכך, ההתאמה יוצאת הדופן של שיגלה להדבקה של פונדקאים אנושיים מחייבת שימוש בתרביות תאים שמקורן בבני אדם כדי ליצור מחדש מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לחקירה מדויקת של פתוגנזה של שיגלה.
כאן, מתוארים נהלים מפורטים כדי למדוד את שיעורי ההיצמדות של Shigella , פלישה ושכפול בתוך תאי אפיתל המעי הגס HT-29. באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים אלה, ניתן לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם גנים של אלימות חיידקית ואותות סביבתיים משפיעים על כל שלב של זיהום שיגלה כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין הדינמיים בין המארח לפתוגן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m PES filter</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td>17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>Plates are treated for optimal cell attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8756</td>
			<td>1:1 ratio of cholate to deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6277</td>
			<td>A benzidine-based anionic diazo dye, &#62;85% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>To be used with the Countess Automated Cell Counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>A a highly polar organic reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat-inactivated, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632</td>
			<td>Stock concentration is 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td>Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM999</td>
			<td>Laboratory sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1x concentration; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>30391023</td>
			<td>A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td>Tissue culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>A common non-ionic surfactant and emulsifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8907</td>
			<td>Bacterial growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epithelial cell infection analyses with shigella

הפתוגן החיידקי האנטרי המותאם לבני אדם שיגלה גורם למיליוני זיהומים מדי שנה, יוצר השפעות גדילה ארוכות טווח בקרב ילדים ומהווה גורם מוביל למוות משלשולים ברחבי העולם. זיהום גורם לשלשול מימי או דמי כתוצאה מכך שהפתוגן עובר במערכת העיכול ומדביק את תאי האפיתל המצפים את המעי הגס. עם עלייה מדהימה בעמידות לאנטיביוטיקה והמחסור הנוכחי בחיסונים מאושרים, פרוטוקולי מחקר סטנדרטיים הם קריטיים לחקר הפתוגן האימתני הזה. כאן מוצגות מתודולוגיות לבחינת הפתוגנזה המולקולרית של שיגלה באמצעות אנליזות חוץ גופיות של היצמדות חיידקים, פלישה ושכפול תוך-תאי בתאי אפיתל המעי הגס. לפני ניתוח הזיהום, פנוטיפ האלימות של מושבות שיגלה אומת על ידי ספיגת הצבע האדום של קונגו על לוחות אגר. ניתן לשקול גם שימוש בחומרי מעבדה מוספים במהלך תרבית חיידקים כדי לחקות בתנאי in vivo . תאי חיידקים משמשים לאחר מכן בפרוטוקול סטנדרטי כדי להדביק תאי אפיתל המעי הגס בלוחיות תרבית רקמה בריבוי מבוסס של זיהום עם התאמות לנתח כל שלב של זיהום. לצורך בדיקות היצמדות, תאי שיגלה מודגרים עם רמות מדיה מופחתות כדי לקדם מגע חיידקי עם תאי אפיתל. הן עבור פלישה והן עבור מבחני שכפול תוך תאי, גנטמיצין מיושם בפרקי זמן שונים כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים ולאפשר הערכה של פלישה ו / או כימות של שיעורי שכפול תוך תאי. כל פרוטוקולי ההדבקה מונים חיידקים דבקים, פלשו ו / או תוך תאיים על ידי דילול סדרתי של תאי אפיתל נגועים וציפוי יחידות יוצרות מושבת חיידקים ביחס לטיטרים מדביקים על לוחות אגר אדומים בקונגו. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים אפיון עצמאי והשוואות עבור כל שלב של זיהום Shigella של תאי אפיתל כדי לחקור פתוגן זה בהצלחה.

Diarrheal diseases caused by enteric bacterial pathogens are a significant global health burden. In 2016, diarrheal diseases were responsible for 1.3 million deaths worldwide and were the fourth leading cause of death in children younger than five years of age1,2. The Gram-negative, enteric bacterial pathogen Shigella is the causative agent of shigellosis, a major cause of diarrheal deaths worldwide3. Shigellosis causes significant morbidity and mortality each year in children from lower- and middle-income countries4,5, while infections in high-income countries are linked to daycare center, foodborne, and waterborne outbreaks6,7,8,9. Ineffective vaccine development10 and rising rates of antimicrobial resistance (AMR)11,12 have complicated the management of large-scale Shigella outbreaks. Recent Centers for Disease Control and Prevention data show that nearly 46% of Shigella infections in the United States displayed drug resistance in 202013,14, while the World Health Organization has declared Shigella as an AMR priority pathogen for which new therapies are urgently needed15.
Shigella infections are easily transmitted via the fecal-oral route upon ingestion of contaminated food or water, or through direct human contact. Shigella has evolved to be an efficient, human-adapted pathogen, with an infectious dose of 10-100 bacteria sufficient to cause disease16. During small intestinal transit, Shigella is exposed to environmental signals, such as elevated temperature and bile17. Detection of these signals induces transcriptional changes to express virulence factors that enhance the ability of the bacteria to infect the human colon17,18,19. Shigella does not invade the colonic epithelium from the apical surface, but rather transits across the epithelial layer following uptake into specialized antigen-presenting microfold cells (M cells) within the follicle-associated epithelium20,21,22. Following transcytosis, Shigella cells are phagocytosed by resident macrophages. Shigella rapidly escapes the phagosome and triggers macrophage cell death, resulting in the release of pro-inflammatory cytokines5,23,24. Shigella then invades colonic epithelial cells from the basolateral side, lyses the macropinocytic vacuole, and establishes a replicative niche in the cytoplasm5,25. Pro-inflammatory cytokines, particularly interleukin-8 (IL-8), recruit polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) to the site of infection, which weakens epithelial tight junctions, and enables bacterial infiltration of the epithelial lining to exacerbate basolateral infection5. The PMNs destroy the infected epithelial lining to contain the infection, which results in the characteristic symptoms of bacillary (bloody) dysentery5. Although invasion and intracellular replication mechanisms have been thoroughly characterized, new research is demonstrating important new concepts in Shigella infection, including virulence regulation during gastrointestinal (GI) transit17, adherence19, improved basolateral access through barrier permeability26, and asymptomatic carriage in malnourished children27.
The ability of Shigella spp. to cause diarrheal disease is restricted to humans and non-human primates (NHP)28. Shigella intestinal infection models have been developed for zebrafish29, mice30, guinea pigs31, rabbits21,32,33, and pigs34,35. However, none of these model systems can accurately replicate the disease characteristics observed during human infection36. Although NHP models of shigellosis have been established to study Shigella pathogenesis, these model systems are expensive to implement and require artificially high infectious doses, up to nine orders of magnitude higher than the infectious dose of humans37,38,39,40,41,42. Thus, the remarkable adaptation of Shigella for infection of human hosts necessitates the use of human-derived cell cultures to recreate physiologically relevant models for accurate interrogation of Shigella pathogenesis.
Here, detailed procedures are described to measure the rates of Shigella adherence to, invasion of, and replication within HT-29 colonic epithelial cells. Using these standardized protocols, the molecular mechanisms by which bacterial virulence genes and environmental signals impact each step of Shigella infection can be interrogated to better understand the dynamic host-pathogen interaction relationship.

מחבר זרקור: התקדמות בהבנה ובמאבק בדלקות שיגלה

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

Shigella is a significant global pathogen that causes devastating infection rates every year. Shigella infects the gastrointestinal tract to cause diarrhea or dysentery. Our research aims to improve our understanding of infection to help develop more effective therapeutics like vaccines and other antimicrobial products.First, animal models and emerging tissue culture techniques allow us to better understand the physiology of Shigella infection and faithfully reproduce the complexity of the human GI tract. Second, characterization of clinical Shigella isolates has helped to capture the diversity of this genus, identify important virulence genes, and improve our understanding of infection. We have used gastrointestinal signals like bile salts and glucose to understand how Shigella survives transit in the small intestine and regulates virulence gene expression for infection in the large intestine.We have demonstrated how Shigella resists bile salts and have shown that Shigella produces adherence proteins to help initiate contact with epithelial cells to start infection. These protocols are designed to look at key aspects of epithelial infection like adherence, invasion, and intracellular survival of Shigella. We are performing these protocols using a standard epithelial cell line, but have also adapted the methods for sophisticated human GI models that are now available.These protocols consider each phase of infection independently, which is critical to understand the key steps in Shigella infection. They also highlight that combined analyses can facilitate a greater understanding of Shigella infection at a holistic level.

בדיקות היצמדות, פלישה ושכפול תוך-תאי בוצעו בהשוואה בין S. flexneri 2457T wild type (WT) ל-S. flexneri ΔVF (ΔVF), מוטנט ששיערו כי הוא מווסת באופן שלילי את אלימות Shigella. מכיוון ששיגלה משתמשת במלחי מרה כאות לוויסות אלימות 17,18,47, ניסויים בוצעו לאחר תת-תרבית חיידקית במדיה TSB וכן TSB בתוספת 0.4% (w/v) מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

שיגלה הוא פתוגן עולמי משמעותי הגורם לשיעורי זיהום הרסניים מדי שנה. שיגלה מדביקה את מערכת העיכול וגורמת לשלשולים או דיזנטריה. המחקר שלנו נועד לשפר את ההבנה שלנו לגבי זיהומים כדי לעזור לפתח טיפולים יעילים יותר כמו חיסונים ומוצרים אנטי-מיקרוביאליים אחרים.ראשית, מודלים של בעלי חיים וטכניקות מתפתחות של תרביות רקמה מאפשרים לנו להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה של זיהום שיגלה ולשחזר נאמנה את המורכבות של מערכת העיכול האנושית. שנית, אפיון של מבודדי שיגלה קליניים סייע ללכוד את המגוון של סוג זה, לזהות גנים אלימים חשובים ולשפר את הבנתנו את הזיהום. השתמשנו באותות במערכת העיכול כמו מלחי מרה וגלוקוז כדי להבין כיצד שיגלה שורדת מעבר במעי הדק ומווסתת ביטוי גנים אלימים לזיהום במעי הגס.הדגמנו כיצד Shigella מתנגדת למלחי מרה והראינו כי Shigella מייצרת חלבוני דבקות כדי לעזור ליזום מגע עם תאי אפיתל כדי להתחיל זיהום. פרוטוקולים אלה נועדו לבחון היבטים מרכזיים של זיהום אפיתל כמו היענות, פלישה והישרדות תוך תאית של שיגלה. אנו מבצעים פרוטוקולים אלה באמצעות קו תאי אפיתל סטנדרטי, אך גם התאמנו את השיטות למודלים מתוחכמים של מערכת העיכול האנושית הזמינים כיום.פרוטוקולים אלה לוקחים בחשבון כל שלב של זיהום בנפרד, וזה קריטי כדי להבין את השלבים העיקריים בזיהום Shigella. הם גם מדגישים כי ניתוחים משולבים יכולים להקל על הבנה טובה יותר של זיהום Shigella ברמה הוליסטית.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

573 Views.  Massachusetts General Hospital. שיגלה הוא פתוגן עולמי משמעותי הגורם לשיעורי זיהום הרסניים מדי שנה. שיגלה מדביקה את מערכת העיכול וגורמת לשלשולים או דיזנטריה. המחקר שלנו נועד לשפר את ההבנה שלנו לגבי זיהומים כדי לעזור לפתח טיפולים יעילים יותר כמו חיסונים ומוצרים אנטי-מיקרוביאליים אחרים.ראשית, מודלים של...

Video: מחבר זרקור: התקדמות בהבנה ובמאבק בדלקות שיגלה

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.