אנו חוקרים את המיקרוביוטה שחיה בגינות פטריות על נמלים שמגדלות פטריות. אנו רוצים לדעת מי הם וכיצד הם מארגנים את המערכת האקולוגית המיקרוביאלית הזו. בפרט, אנו רוצים לדעת כיצד המיקרוביוטה מתקשרת פיזית עם הפטרייה שהנמלים מטפחות.
והאינטראקציות האלה מתווכות בעיקר על ידי ביופילם. הגנים המיקרוביאליים המעובדים על ידי הנמלים הם מדגם מורכב והטרוגני המורכב מהפטרייה המתורבת, המצע שנוסף לגידול והמיקרוביוטה. מלבד היותה עדינה מאוד, מאתגר למצוא שיטות המשמרות את כל רכיבי הגן להדמיה.
הממצאים שלנו מצביעים על כך שהמיקרוביוטה משלבת את מבני גן הפטריות, מה שתומך גם בכך שהם עשויים להשתתף בתגובות הפיזיולוגיות של סביבה זו. ואנו גם מספקים את מערכת הראיות לכך שביופילמים חשובים לאינטראקציות אלה. הפרוטוקול שלנו משמר מבני פטריות בביופילמים תוך פישוט תהליכים אחרים.
עם זאת, הוא משמר את מבנה הגן העדין, מפרט עוד יותר את האינטראקציה הפיזית של המיקרוביוטה וחושף את המבנה המרחבי של הביופילם. ביופילם הן מערכות תאיות שבהן מיקרואורגניזמים המשובצים במטריצת EPS יוצרים רשתות חברתיות. סריקת מיקרוסקופיה אלקטרונית מאפשרת לנו להתבונן בפירוט חסר תקדים כיצד המיקרוביוטה מתארגנת מרחבית בגן הפטריות, סביב קורים ובכל רחבי המצע.
אנו מאמינים כי צעדי ההכנה שאנו מציעים כאן ייושמו באופן נרחב לשכלול מחקרים במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות אחרות. בתור התחלה, אתרו וסמנו את מושבת מיני הנמלים האטין. חפרו תעלה המקיפה את אזור הקן עד לחשיפת חדר הגן.
פתחו את תא הגינה לרוחב כדי למנוע מהאדמה לקרוס על פני הגינה. באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים, בזהירות לאסוף דגימות גינה. מעבירים את דוגמאות הגינה למיכל פלסטיק נקי המכיל שכבת טיח לאיזון הלחות.
לאחר העברת עובדי הגינה והנמלים, אטמו הרמטית את המיכל כדי למנוע התייבשות דגימה. סגור את התעלה באמצעות הקרקע שהוסרה בעבר. אחסנו את דגימות הגן בטמפרטורה של 23 עד 25 מעלות צלזיוס, עד לעיבוד נוסף.
לקיבוע דגימות, השתמשו במלקחיים אנטומולוגיים כדי להסיר עובדים, ביצים, גלמים וזחלים מדגימות הגינה. מניחים בצד שברי גינה שגודלם אינו עולה על חמישה מילימטרים מעוקבים ומוסיפים אותם לצינור של שני מיליליטר. לאחר מכן עם פיפטה זכוכית פסטר, להוסיף כמיליליטר אחד של פתרון קיבוע Karnofsky לצינורות כדי לטבול לחלוטין את הדגימות.
יש להסעיר את הצינורית בעדינות כדי לאפשר לדגימות להשרות ולדגור על הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. כדי להתחיל, להשיג שברי מושבה של מיני נמלים אטין בתמיסת קיבוע קרנופסקי. לאחר הקיבוע, להסיר לחלוטין את הפתרון המקבע של קרנופסקי באמצעות פיפטה זכוכית מבלי לשבש את הדגימה.
לדגור את הדגימה באופן סדרתי עם מיליליטר אחד של ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול, להבטיח את הדגימה נשארת ללא הפרעה. לאחר הסרת האתנול לחלוטין, באמצעות מלקחיים ומרית, העבירו בזהירות את הדגימה למיכל דגימה עבור מייבש הנקודה הקריטית. הניחו את המכסה על המיכל וטבלו אותו בכוס זכוכית מדורגת המכילה מספיק 100% אתנול כדי לטבול את המיכל.
לאחר מכן העבירו את מיכל הדגימה לכוס זכוכית מדורגת אחרת המכילה מספיק 100% אתנול. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן העבירו את המיכל למייבש הנקודה הקריטית.
כדי להתחיל, להשיג שברי מושבה של מיני נמלים אטין הנתונים לייבוש נקודה קריטית. כדי להכין את מחזיקי המדגם, לעטוף את הגבעולים עם חתיכת נייר אלומיניום, מכסה רק את החלק העליון. כתוב את הקוד או המספר לדוגמה בתחתית כל גבב כדי לזהות אותם, לפני כיסוי החלק העליון של הספח בסרט פחמן דו-צדדי.
לאחר מכן פתחו את מכסה מיכל הדגימה והעבירו בזהירות את הדגימה המיובשת לצלחת פטרי מזכוכית באמצעות מלקחיים ומרית. הניחו בזהירות שברים של דגימת הגינה על המשטח הדביק של הספח המכוסה בסרט. לאחר ציפוי השפריץ בזהב, הניחו את הגבעולים במחזיק הדגימה לצורך סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
השתמשו באפשרויות שעל המסך או בבקרה הידנית כדי להתאים את ההגדלה ואת מיקום התמונה. הזז את הבמה כדי לקבל תצוגה מקיפה של הדגימה. השתמש בפונקציה RDC כדי להתמקד באזורים ספציפיים.
כאשר מתבוננים במבנה מעניין, התאימו את ההגדלה, המיקוד, הבהירות, הניגודיות והסטיגמה בהתאם. עבור סטיגמה נכונה, באמצעות ממשק המשתמש הידני, להזיז את הבמה בכיוון X ו- Y. התאימו את קצב הרסטר כדי לבדוק את רזולוציית התמונה.
התאימו את ההגדלה בהתאם לחלק המצולם. כדי לשמור את התמונה, השתמש בפונקציית ההקפאה ולחץ על סמל התמונה. הגדר את נתיב הקובץ לשמירת התמונה.
לבסוף, נתחו לפחות שלושה שברי גן, ולכדו תמונות בכל טווחי ההגדלה שהוזכרו. קורים פטרייתיים בגני אטין נצפו כמבנים שלמים בצורת צינור המכסים את פני המצע, דבר המצביע על הכנת דגימה יעילה. הביופילמים שהתפשטו הורכבו מתאים מיקרוביאליים שיצרו שכבה דקה של תא אחד עד שלושה תאים שכיסתה את פני המצע.
