מחקר זה זכה לתמיכה מפרויקט QNano http://www.qnano-ri.eu שממומן על ידי תשתיות המחקר של הקהילה האירופית במסגרת תכנית FP7 נפחים (מענק מס &#39;אינפרא 2010-262,163). אנו מודים גם למועצת המחקר Formas לתמיכה כספית.

<ol>
	<li>Echlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low Temperature Microscopy and Analysis. , (1992).</li><li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+Transmission+Electron+Microscopy.">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy.</a> J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).</li><li>Studer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing.">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285 (2001).</li><li>Umrath, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+bath+for+rapid+freezing+in+electron+microscopy.">Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy.</a> J. Microsc. 101, 103 (1974).</li><li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples.">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212, 34 (2003).</li><li>Elder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , (1989).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Focused Ion Beams. , (2005).</li><li>Marko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryoelectron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy.</a> Nat. Methods. 4, 215 (2007).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+frozen-hydrated,+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy.">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).</li><li>Rigort, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).</li><li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples.">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> J. Microsc. 131, 1 (1983).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+improved+focused+ion+beam+milling+of+cryo-prepared+life+science+specimens.">A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens.</a> J. Microsc. 226, 263 (2007).</li><li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision.">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).</li><li>W&#228;tjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu+out-diffusion+in+kesterites—A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact.">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה הוא הסתגלות ולא פשוטה לקירור של הכנת מדגם FIB / TEM הסטנדרטי המשמשת במדעי חומר ב RT. השיטה מייצרת דגימות TEM ללא עיוות מכאנית וסימני סכין (החסרון העיקרי של microtomy), אם כי מסוך עלול להתרחש אם מדגם השטח הוא הומוגניות. זה יכול להיות מופחת על ידי cryo-תצהיר של שכבת מכסת (בעבודה זו Pt היה בשימוש), נרפאה עד שהוא חלק וייחוד 13. ניתן להכין דוגמאות עם רכיבים של קשיות שונות מאוד, כמו גם ללא הסיכון שהם יישברו תחת לחץ במהלך הכנה. לחצים פנימיים עדיין עשויים לגרום lamella הדק לכופף או תלתל, ובמקרה זה בגודל של הסעיף צריך להיות מופחת. חסרון בהשוואה לשיטה אחרת הוא האפשרות לשנות את המבנה הביולוגי עקב חשיפה לאלומת היונים והשתלה אפשרית של היונים במדגם. חסרונות אלה להתרחש גם ב RT עבור prepar המדגםation במדע חומרים 15. הם יכולים להיות מופחתים על ידי מילוי הדליל בצעד ליטוש סופי במתח המאיץ הנמוך ביותר ליונים (500-1,000 V). צעד ליטוש עדין מאוד זה יהיה להסיר את השכבה הפגועה מlamella. בשל אופייה של cryo-בתצהיר (שלבים 3.5, 3.10 ו3.13), חלקים גדולים של המדגם יהיו מכוסים, ובכך חוסמים את הנוף של פני השטח המקוריים. זה עשוי להקשות כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה, אלא אם כן סימונים מרובים נמצאים בשימוש כפי שהוצעו בשלב 3.3. במהלך שלבים 4.5 ו4.7 סיכוני lamella דקים שבאו במגע עם אוויר. זו יש להימנע כפי שהוא עלול לגרום ללחות באוויר בצורת גבישי קרח על פני השטח של המדגם, אולי עד כדי טשטוש תכונות חשובות. עליך לבצע פעולות אלה מהר ככל האפשר, אבל באותו הזמן טיפולו הכושל במהלך ההעברה עלול לגרום לאובדן של המדגם זהעצמי. מומלץ שהמשתמש נוקט צעדים אלה באמצעות רשתות TEM ריקות לפני ניסיון על מדגם אמיתי הוא עשה. במדעי חומר, מכשיר FIB הפך את השיטה הראשית של הכנת מדגם TEM בתוך עשור של המסחור שלה. שכן הוא יכול לשמש כמעט על כל דגימה, הוא מסיר את הצורך להתאים את טכניקת ההכנה לסוג של מדגם. אנו מאמינים באותו יכול לקרות בקירור, הודות להליך המפורט כאן. היישום שלה לדגימות גדולות יותר הוא עדיין כפוף ליכולת Cryo-לשמר אותם במצב מזוגג, אבל טכניקות כגון צניחה-הקפאה או בלחץ גבוה הקפאת 3,5 יכולות להוכיח להיות הפתרון האופטימלי לבעיה זו.

בפרוטוקול זה cryo-FIB/SEM משמש להפקת דגימות TEM מאזור מסוים של המדגם, זוהה בעבר עם דיוק גבוה על ידי ניתוח SEM. ניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים (סריקה או העברת) של דגימות ביולוגיות הוא טכניקה שגרתית המשמשת למחקר ואבחון. SEM הוא די מהיר וקל להעסיק ולפרש, אבל מידע מתקבל רק ממדגם השטח ועם רזולוציה בטווח 1.5 ננומטר. יש TEM ברזולוציה גבוהה יותר, אך קשה יותר ליישום, ניתוח התמונה הוא פחות ישיר ואילו מידע בתפוצה רחבה מתקבל, דגימות צריכה להיות דלילה אלקטרוני שקיפות (פחות מ כ -500 עבה ננומטר). בעיה נוספת היא שדרישות הוואקום של אותם מכשירים נסבלות לעתים רחוקות על ידי דגימות המכילים מים. ברוב המקרים, דגימות ביולוגיות צריכים להיות קבועות או כימי (החלפת מים עם, למשל, פולימרים) או מיובש. בשני המקרים, שינויים משמעותייםמורפולוגיה ומבנה של הדגימה צפויה להופיע. הכנת Cryo TEM של דגימות התייבשות גורמת לשינויים כימיים מינימאליים והיא מייצרת דגימות קרובה ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, במיוחד אם vitrification קרח מתקבלת 1-6. FIB נעשה שימוש נרחב להכנת דגימות TEM ליתרונות הרבים שלה 7. עד כמה שם: השימוש ביונים עתירה אנרגיה בשכיחות כמעט נורמלית ממזער את השפעת השינויים בשערי כרסום ההפרש הקשורים לחומר; ניתן לבחור את האזור שחולץ מן המדגם בתפזורת עם דיוק תת מיקרון; כמות קטנה מאוד של חומר מופק. כמה התפתחויות טכניות האחרונות התאפשרו באמצעות FIB גם להכנת מדגם TEM בקירור 2,8-10. ישנם מספר יתרונות על פני שיטת ההכנה המסורתית של cryo-microtomy 11,12 משמש בעיקר לדגימות חומר רך, כגון חוסר העיוות מכאנית של lamella הפרוס,העדר סימני סכין והאפשרות להכנת דגימות מורכבות עם ממשקים קשים / רכים או רכיבים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשמש להכנת דגימות cryo-TEM של נבגי ניז&#39;ר ​​אספרגילוס, אך אשר יכולים בקלות להיות מותאם עבור כל מספר של מיקרואורגניזמים או פתרונות. אנו עושים שימוש בתחנת cryo-העברה בנויה מותאם אישית וחדר הכנת cryo-SEM שונה 2. נבגי לקוחים מתרבות, לצלול, קפוא בחנקן נוזלי רפש ונצפו בcryo-SEM כדי לבחור אזור של עניין. Lamella דקה לאחר מכן הופקה באמצעות FIB, מחובר לרשת TEM ולאחר מכן דליל אלקטרוני שקיפות. הרשת מועברת לבעל cryo-TEM ולTEM ללימודים ברזולוציה גבוהה. בזכות כניסתה של טיפ nanomanipulator מקורר ותחנת cryo-העברה, פרוטוקול זה הוא עיבוד ישיר לטמפרטורת קירור של הכנת FIB בשימוש שגרתית של דגימות TEM. ככזה יש לו את היתרונות של צורך בכמות קטנה של שינויים במכשירים, הגדרות ונהלים קיימים; אני זהזה קל ליישום; יש לו מגוון רחב של יישומים, באופן עקרוני זהה להכנת מדגם cryo-TEM. מגבלה אחת היא שזה דורש טיפול מיומן של הדגימות בשלבים קריטיים, כדי למנוע או למזער את זיהומים.

בעבודה זו עשינו שימוש ב: הקורה כפול FIB / SEM מצויד בnanomanipulator וקאמרי cryo-הכנה; TEM עם בעל cryo-העברה; תחנת cryo-העברת אב טיפוס. Anticontaminator (AC) להבים של חדר cryo-ההכנה וקצה nanomanipulator (NM) שונו על ידי Gatan. עם כל כבוד לקאמרי cryo-הכנה סטנדרטית, להבי AC גדולים יותר כדי לספק גוף קירור גדול יותר לקצה NM. יתר על כן, AC מצויד במהדק לחיבור צמות Cu להחלפת חום עם קצה NM. הפנאומטיקה של FIB / SEM שונו כדי לאפשר NM להיות ולהישאר גם כאשר הוכנסה לתא המדגם פרקה. יש לציין כי הפרמטרים המשמשים בעבודה זו מתאימים ביותר לציוד המפורט לעיל; פרמטרים אלה עלולים צריכים להיות מותאמים בעבודה עם סוגים אחרים של ציוד. כדי לעבוד עם פרוטוקול זה, אמצעי הזהירות הרגילה לטיפול בנושא הקפאה, מערכות חנקן וואקום נוזל צריכהלהיות אחריו. השיטה נבדקה על סוגים שונים של דגימות עם תוצאות טובות, החל מפתרונות או מטריצות פולימר המכילות חלקיקים, לאורגניזם חד תאי לנמטודות. דוגמאות לשלבים השונים של ההליך באים לידי ביטוי בדמויות 1-12 בא נבגי ניז&#39;ר ​​מוכתמים בtetroxide אוסמיום וpermanganate אשלגן. הנבגים הם צילמו לראשונה על ידי SEM (איור 1) לזהות את האתר להפקה. במקרה זה, חתך של כל נבג היה מספיק, אבל זה אפשרי למקם את ההחזר על ההשקעה עבור חילוץ עם דיוק תת מיקרומטר, למשל, פורס תא מסוים במרחק מסוים מקרום התא. ברגע שהתכונה של עניין זוהתה, הצעד הראשון של תצהיר cryo-Pt מיושם (איור 2), כדי להגן על המדגם מנזק קורה מכרסום יון. המדגם מוטה ל52 ° להמשיך עם o הצעדים הראשוניםו הטחינה (איור 3): המקרטעת של שתי תעלות משני צידי lamella. המדגם מוטה לאחור ולאחר מכן עוד הסתובב לעזוב רק שני גשרים קטנים המחברים אותו לתפוצה הרחבה (איור 4). Nanomanipulator מקורר הוא הביא במגע עם אמילה (איור 5) ועוד cryo-תצהיר של Pt חיילים אותם יחד (איור 6). אז גשרי חיבור הקטנים הם הסתובבו שם וNM נע lamella בסמוך לאזור החיבור של רשת TEM (איור 7), שבו הוא מולחם עם cryo-תצהיר סופי של Pt (איור 8). NM מכן הופרד מlamella (איור 9), שהוא דלל את אלקטרוני שקיפות עם אלומת היונים (איור 10 ו11). Lamella לבסוף הועברה לTEM (איור 12) שבו הדמיה ברזולוציה גבוהה, ספקטרוסקופיה, טומוגרפיה וטכניקות אחרות can להיות מועסק. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> איור 1. תמונת Cryo-SEM של נבגים של א &#39; ניז&#39;ר, לפני תצהיר Pt. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> איור 2. אותו האזור באיור 1 לאחר בתצהיר Pt אבל לפני הריפוי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> איור 3. תמונת Cryo-SEM של אותו האזור באיור 2, מוטה 52 º, לאחר בתצהיר Pt וריפוי, עם טחינת תעלה לדרך(ראה שלב 3.7). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> איור 4. Lamella, מוכנה לעילוי-out. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> איור 5. קצה nanomanipulator הקר יוצר קשר עם lamella. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> איור 6. Cryo-תצהיר Pt שני משמש לרתך יחד nanomanipulator וlamella. <i<html> גובה מ&quot;ג = &quot;איור 7&quot; עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; src איור 7. Nanomanipulator הקר משמש להעברת lamella לאזור החיבור של רשת TEM. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> איור 8. קריו בתצהיר משמש פעם נוספת לצרף lamella לרשת TEM. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> איור 9. Lamella נחתך ללא nanomanipulator והוא מוכן כעת לאו אחסון או דילול אלקטרוני שקיפות. = &quot;תמיד&quot;&gt; בתוך עמודים <img alt="איור 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> איור 10. שלב ביניים של הדילול, עם כמה נבגים נראים בחתך. <img alt="איור 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> איור 11 תמונת Cryo-SEM של המדגם לאחר דילול סופי.; רוב הנבגים האחרים היה צריכים להיות הסתובבו משם כי lamella התחילה להתנפח. <img alt="איור 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> איור 12. תמונת cryo-TEM מורכב של lamella. חלק מבדל אל נכללבlamella (החץ שחור).

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam at JoVE.com

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

JoVE Journal

Biology

26.4K Views.  Uppsala University.  Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים...

Video: Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

בלוק תא הכנה מן הדגימה ציטולוגיה עם דומיננטיות של תאים פזורים בנפרד

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. For many years electron microscopy (EM) has remained an inherently two-dimensional technique. With the advent of serial scanning electron microscope imaging techniques (volume EM), using either an integrated microtome or focused ion beam to slice then view embedded tissues, the third dimension becomes easily accessible. Serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) uses an ultramicrotome enclosed in the SEM chamber. It has the capability to handle large specimens (1,000 &#181;m x 1,000 &#181;m) and image large fields of view at small X,Y pixel size, but is limited in the Z dimension by the diamond knife. Focused ion beam SEM (FIB-SEM) is not limited in 3D resolution, (isotropic voxels of &#8804;5 nm are achievable), but the field of view is much more limited. This protocol demonstrates a workflow for combining the two techniques to allow for finding individual regions of interest (ROIs) in a large field and then imaging the subsequent targeted volume at high isotropic voxel resolution. Preparing fixed cells or tissues is more demanding for volume EM techniques due to the extra contrasting needed for efficient signal generation in SEM imaging. Such protocols are time consuming and labor intensive. This protocol also incorporates microwave assisted tissue processing facilitating the penetration of reagents, which reduces the time needed for the processing protocol from days to hours.

Here, we present a protocol for efficiently combining serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy to target an area of interest. This allows for efficient searching, in three dimensions, and locating rare events in a large field of view.

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.