Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: <em>Ex vivo</em> RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Brown University 

&#x5E38;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x663E;&#x6027;&#x9690;&#x6027;&#x4E3B;&#x5C0F;&#x5934;&#x7578;&#x5F62;&#x662F;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x6A21;&#x578B;&#xFF0C;&#x7528;&#x6765;&#x7814;&#x7A76;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x5927;&#x8111;&#x751F;&#x957F;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5C55;&#x793A;&#x4E24;&#x79CD;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7684;&#x6DF7;&#x4E71;&#x5BFC;&#x81F4;&#x4ECE; CDK5RAP2 &#x548C; CENPJ &#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EAF;&#x5408;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x795E;&#x7ECF;&#x4E0A;&#x76AE;&#x8868;&#x8FBE;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6709;&#x4E1D;&#x5206;&#x88C2;&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8F74;&#x6781;&#x4EA7;&#x524D;&#x795E;&#x7ECF;&#x53D1;&#x751F;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x6697;&#x793A; centrosomal &#x673A;&#x5236;&#x63A7;&#x5236;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x56FD;&#x5BB6;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x8111;&#x5185;&#x7684;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x6570;&#x91CF;&#x3002;

&#x6D89;&#x53CA; CDK5RAP2 &#x548C; CENPJ centrosomal &#x673A;&#x5236;&#x63A7;&#x5236;&#x5927;&#x8111;&#x5C3A;&#x5BF8;&#x3002;

Autosomal recessive primary microcephaly is a potential model in which to research genes involved in human brain growth. We show that two forms of the disorder result from homozygous mutations in the genes CDK5RAP2 and CENPJ. We found neuroepithelial expression of the genes during prenatal neurogenesis and protein localization to the spindle poles of mitotic cells, suggesting that a centrosomal mechanism controls neuron number in the developing mammalian brain.

A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size.

Autosomique r&eacute;cessive microc&eacute;phalie de primaire est un mod&egrave;le dans lequel &agrave; la recherche des g&egrave;nes impliqu&eacute;s dans la croissance du cerveau humain. Nous montrons que les deux formes de la maladie r&eacute;sultent de mutations homozygotes dans les g&egrave;nes CDK5RAP2 et CENPJ. Nous avons trouv&eacute; l&#39;expression des g&egrave;nes neuro&eacute;pith&eacute;liales pendant la localisation pr&eacute;natale de neurogen&egrave;se et prot&eacute;ines aux p&ocirc;les du fuseau des cellules mitotiques, ce qui sugg&egrave;re qu&#39;un m&eacute;canisme de centrosomes contr&ocirc;le nombre de neurones dans le cerveau des mammif&egrave;res en voie de d&eacute;veloppement.

Un m&eacute;canisme de centrosomes impliquant CDK5RAP2 et CENPJ contr&ocirc;le la taille du cerveau.

Autosomal rezessive prim&auml;re Mikrozephalie ist ein Modell in der Forschung von Genen, die im menschlichen Gehirn Wachstum. Wir zeigen, dass zwei Formen der Erkrankung in homozygote Mutationen in den Genen CDK5RAP2 und CENPJ. Wir fanden Gliazellen Ausdruck der Gene w&auml;hrend der pr&auml;natalen Neurogenese und Protein-Lokalisierung an die Spindel-Polen der mitotischen Zellen, was darauf hindeutet, dass ein centrosomal Mechanismus Neuron Nummer in das sich entwickelnde S&auml;ugetier-Gehirn steuert.

Ein centrosomal Verfahren ein, CDK5RAP2 und CENPJ steuert Gehirngr&ouml;&szlig;e.

Autosomica recessiva microcefalia primaria &egrave; un potenziale modello nel quale alla ricerca di geni coinvolti nella crescita del cervello umano. Mostriamo che due forme di disturbo derivano da mutazioni omozigoti nei geni CDK5RAP2 e CENPJ. Abbiamo trovato neuroepithelial espressione dei geni durante la localizzazione di neurogenesi e proteina prenatale ai poli mandrino di mitosi delle cellule, suggerendo che un meccanismo di centrosomal controlla il numero di neuroni nel cervello dei mammiferi in via di sviluppo.

Un meccanismo centrosomal che coinvolgono CDK5RAP2 e CENPJ controlla la dimensione del cervello.

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CDK5RAP2 &#x3068; CENPJ &#x3092;&#x542B;&#x3080; centrosomal &#x6A5F;&#x69CB;&#x8133;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x3055;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xAE30;&#xBCF8; microcephaly &#xC0C1; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xC5F4;&#xC131; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xAC00; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xB1CC; &#xC131;&#xC7A5;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBAA8;&#xB378;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC7A5;&#xC560;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD615;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; CDK5RAP2 &#xBC0F; CENPJ &#xC720;&#xC804;&#xC790; homozygous &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; centrosomal &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xB450;&#xB1CC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC218; &#xC81C;&#xC5B4; mitotic &#xC140;&#xC758; &#xC2A4;&#xD540; &#xB4E4; &#xAE30;&#xB465;&#xC5D0; &#xD0DC;&#xC544;&#xC758; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC2E0;&#xC0DD; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; neuroepithelial &#xC2DD; &#xBC1C;&#xACAC;.

Cdk5rap2&#xACFC; CENPJ centrosomal &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xB1CC; &#xD06C;&#xAE30;&#xB97C; &#xC81C;&#xC5B4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Microcefalia primaria recesivo autos&oacute;mico es un posible modelo en el que de genes implicados en el crecimiento del cerebro humano. Mostramos que dos formas de la enfermedad como resultado de mutaciones homocig&oacute;ticas en los genes CDK5RAP2 y CENPJ. Encontramos expresi&oacute;n de neuroepiteliales de los genes durante la localizaci&oacute;n prenatal de la neurog&eacute;nesis y prote&iacute;na a los polos del huso de c&eacute;lulas mit&oacute;ticas, sugiriendo que un mecanismo controla el n&uacute;mero de neuronas en el cerebro mam&iacute;fero en v&iacute;as de desarrollo.

Un mecanismo se CDK5RAP2 y CENPJ controla el tama&ntilde;o del cerebro.

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While genetic screens have identified many genes essential for neurite outgrowth, they have been limited in their ability to identify neural genes that also have earlier critical roles in the gastrula, or neural genes for which maternally contributed RNA compensates for gene mutations in the zygote. To address this, we developed methods to screen the Drosophila genome using RNA-interference (RNAi) on primary neural cells and present the results of the first full-genome RNAi screen in neurons. We used live-cell imaging and quantitative image analysis to characterize the morphological phenotypes of fluorescently labelled primary neurons and glia in response to RNAi-mediated gene knockdown. From the full genome screen, we focused our analysis on 104 evolutionarily conserved genes that when downregulated by RNAi, have morphological defects such as reduced axon extension, excessive branching, loss of fasciculation, and blebbing. To assist in the phenotypic analysis of the large data sets, we generated image analysis algorithms that could assess the statistical significance of the mutant phenotypes. The algorithms were essential for the analysis of the thousands of images generated by the screening process and will become a valuable tool for future genome-wide screens in primary neurons. Our analysis revealed unexpected, essential roles in neurite outgrowth for genes representing a wide range of functional categories including signalling molecules, enzymes, channels, receptors, and cytoskeletal proteins. We also found that genes known to be involved in protein and vesicle trafficking showed similar RNAi phenotypes. We confirmed phenotypes of the protein trafficking genes Sec61alpha and Ran GTPase using Drosophila embryo and mouse embryonic cerebral cortical neurons, respectively. Collectively, our results showed that RNAi phenotypes in primary neural culture can parallel in vivo phenotypes, and the screening technique can be used to identify many new genes that have important functions in the nervous system.

Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.

Alors que les &eacute;crans g&eacute;n&eacute;tiques ont identifi&eacute; plusieurs g&egrave;nes essentiels &agrave; la croissance des neurites, ils ont &eacute;t&eacute; limit&eacute;s dans leur capacit&eacute; &agrave; identifier des g&egrave;nes neurones qui ont &eacute;galement plus t&ocirc;t un r&ocirc;le crucial dans la gastrula ou g&egrave;nes neuraux dont RNA maternellement apport compense les mutations g&eacute;n&eacute;tiques chez le zygote. Pour y rem&eacute;dier, nous avons d&eacute;velopp&eacute; des m&eacute;thodes &agrave; l&#39;&eacute;cran le g&eacute;nome de la drosophile &agrave; l&#39;aide de l&#39;interf&eacute;rence ARN (ARNi) sur les cellules neuronales primaires et de pr&eacute;senter les r&eacute;sultats du premier &eacute;cran du g&eacute;nome complet Arni dans les neurones. Nous avons utilis&eacute; l&#39;imagerie de cellules vivantes et l&#39;analyse quantitative d&#39;image pour caract&eacute;riser les ph&eacute;notypes morphologiques des neurones primaires fluorescent &eacute;tiquet&eacute;s et cellules gliales en r&eacute;ponse &agrave; v&eacute;hicul&eacute;e par Arni de g&egrave;ne. Sur l&#39;&eacute;cran du g&eacute;nome complet, nous avons concentr&eacute; notre analyse sur 104 g&egrave;nes &eacute;volutivement conserv&eacute;s que quand r&eacute;prim&eacute;s par Arni, ont des anomalies morphologiques comme extension r&eacute;duite axon, ramification excessive, perte de fasciculation et blebbing. Pour aider &agrave; l&#39;analyse ph&eacute;notypique des grands ensembles de donn&eacute;es, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; des algorithmes d&#39;analyse image qui pourraient &eacute;valuer la signification statistique des ph&eacute;notypes mutants. Les algorithmes ont &eacute;t&eacute; essentiels pour l&#39;analyse des milliers d&#39;images g&eacute;n&eacute;r&eacute;es par le processus de pr&eacute;s&eacute;lection et deviendront un outil pr&eacute;cieux pour les futurs &eacute;crans g&eacute;nome dans des neurones primaires. Notre analyse a r&eacute;v&eacute;l&eacute; des r&ocirc;les inattendus, essentiels dans la croissance des neurites g&egrave;nes repr&eacute;sentant un large &eacute;ventail de cat&eacute;gories fonctionnelles, y compris la signalisation des mol&eacute;cules, les enzymes, canaux, r&eacute;cepteurs et les prot&eacute;ines du cytosquelette. Nous avons &eacute;galement constat&eacute; que les g&egrave;nes connus pour &ecirc;tre impliqu&eacute;s dans la prot&eacute;ine et le trafic v&eacute;siculaire montrent ph&eacute;notypes semblables de RNAi. Nous avons confirm&eacute; les ph&eacute;notypes de la prot&eacute;ine traite des neurones du cortex c&eacute;r&eacute;bral g&egrave;nes Sec61alpha et GTPase Ran &agrave; l&#39;aide d&#39;embryon de drosophile et embryonnaire de souris, respectivement. Collectivement, nos r&eacute;sultats ont montr&eacute; que l&#39;ARNi ph&eacute;notypes dans les cultures primaires de neurones peuvent mettre en parall&egrave;le les ph&eacute;notypes in vivo, et la technique de d&eacute;pistage peut servir &agrave; identifier les nombreux nouveaux g&egrave;nes qui ont des fonctions importantes dans le syst&egrave;me nerveux.

Identification de g&egrave;nes de l&#39;excroissance des neurones &agrave; l&#39;aide d&#39;ARNi genome-wide.

W&auml;hrend genetische Schirme f&uuml;r Neurit Auswuchs vieler Gene identifiziert haben, waren sie in ihrer F&auml;higkeit, neuronaler Gene, die auch fr&uuml;her wichtige Rollen in der Gastrula oder neuronalen Gene, die f&uuml;r die maternal eingebrachte RNA Genmutationen in der Zygote ausgleicht identifizieren begrenzt. Hierzu entwickelten wir Methoden zum Bildschirm des Taufliege Genoms mit Hilfe der RNA-Interferenz (RNAi) auf prim&auml;ren Nervenzellen und pr&auml;sentieren die Ergebnisse des ersten voll-Genom RNAi Bildschirms in Neuronen. Wir haben Leben-Zelle Darstellung und quantitative Bildanalyse die morphologischen Ph&auml;notypen von fluorescently beschriftete prim&auml;re Neuronen und Glia als Reaktion auf RNAi-vermittelte gen Niederschlag charakterisieren. Das vollst&auml;ndige Genom-Bildschirm wir den Schwerpunkt unserer Analyse 104 evolution&auml;r konservierte Gene, die als Downregulated durch RNAi, morphologische Defekte wie reduzierte Axon Erweiterung, &uuml;berm&auml;&szlig;ige Verzweigung, Verlust der Faszikulation und Blebbing haben. Unterst&uuml;tzung bei der ph&auml;notypische Analyse gro&szlig;er Datenmengen erzielten wir im Bild-Analyse-Algorithmen, die die statistische Aussagekraft der Mutanten Ph&auml;notypen einsch&auml;tzen konnten. Die Algorithmen f&uuml;r die Analyse von Tausenden von Bildern durch das Screening-Verfahren generiert wurden und werden ein wertvolles Werkzeug f&uuml;r zuk&uuml;nftige genomweiten Bildschirme im prim&auml;ren Neuronen. Unsere Analyse ergab unerwartete, wesentliche Rollen in Neurit Auswuchs f&uuml;r Gene, die eine breite Palette von funktionalen Kategorien, einschlie&szlig;lich signalisieren der Molek&uuml;le, Enzyme, Kan&auml;le, Rezeptoren und Zytoskelett-Proteine. Wir fanden auch, dass Gene bekannt, dass Proteine und Vesikel Handel beteiligt werden &auml;hnliche RNAi-Ph&auml;notypen zeigte. Wir best&auml;tigten Ph&auml;notypen des Proteins Gene Sec61alpha und Ran-GTPase mit Drosophila Embryos und Maus embryonalen zerebrale kortikale Neuronen, bzw. Menschenhandel. Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass die RNAi Ph&auml;notypen in der neuronalen Prim&auml;rkultur k&ouml;nnen parallel in-vivo Ph&auml;notypen und das Screening-Verfahren kann verwendet werden, um viele neue Gene zu identifizieren, die wichtige Funktionen im Nervensystem haben.

Kennung des neuronalen Auswuchs Gene mit genomweiten RNAi.

Mentre gli schermi genetici hanno identificato molti geni essenziali per la crescita dei neuriti, essi hanno limitato nella loro capacit&agrave; di identificare i geni neurali che hanno anche la prima critici ruoli nella gastrula, o geni neurali per cui RNA materna compensa le mutazioni del gene nello zigote. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato metodi per schermo del genoma di Drosophila con interferenza del RNA (RNAi) su cellule neurali primarie e presentare i risultati del primo schermo intero genoma RNAi in neuroni. Abbiamo usato live cell imaging e analisi quantitativa di immagini per caratterizzare i fenotipi morfologici fluorescente coniugati neuroni primari e glia in risposta a RNAi-mediata del gene. Dallo schermo intero genoma, abbiamo focalizzato la nostra analisi su 104 evolutionarily conserved geni che quando downregolata di RNAi, hanno difetti morfologici quali assone ridotta estensione, ramificazione eccessiva, perdita di fascicolazioni e blebbing. Per facilitare l&#39;analisi fenotipica di grandi insiemi di dati, abbiamo generato algoritmi di analisi dell&#39;immagine che potrebbero valutare la significativit&agrave; statistica i fenotipi mutanti. Gli algoritmi sono stati essenziali per l&#39;analisi delle migliaia di immagini generate dal processo di screening e diventeranno un prezioso strumento per futuri genome-wide schermi nei neuroni primari. La nostra analisi ha rivelato ruoli inattesi, essenziali nella crescita dei neuriti per geni che rappresentano una vasta gamma di categorie funzionali tra cui segnalazione molecole, enzimi, canali, recettori e proteine citoscheletriche. Abbiamo anche trovato che geni noti per essere coinvolti nella proteina e il traffico di vescicola ha mostrato simili RNAi fenotipi. Abbiamo confermato fenotipi della proteina traffico cerebrale neuroni corticali geni Sec61alpha e Ran GTPase utilizzando embrioni di Drosophila e mouse embryonic, rispettivamente. Collettivamente, i nostri risultati hanno mostrato che fenotipi RNAi in coltura primaria neurale possono parallelo fenotipi in vivo, e la tecnica di screening pu&ograve; essere utilizzata per identificare molti nuovi geni che hanno importanti funzioni nel sistema nervoso.

Identificazione di geni neurali escrescenza mediante RNAi genome-wide.

&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x795E;&#x7D4C;&#x7A81;&#x8D77;&#x4F38;&#x9577;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x5FC5;&#x9808;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x539F;&#x8178;&#x80DA;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x795E;&#x7D4C;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x306E;&#x6BCD;&#x6027;&#x8CA2;&#x732E;&#x3057;&#x305F; RNA &#x63A5;&#x5408;&#x5B50;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5909;&#x7570;&#x88DC;&#x511F;&#x795E;&#x7D4C;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x306B;&#x5236;&#x9650;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0; RNA &#x5E72;&#x6E09; &#xFF08;RNAi&#xFF09; &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x4E00;&#x6B21;&#x795E;&#x7D4C;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x3067;&#x753B;&#x9762;&#x3057;&#x3001;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x5168;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0; RNAi &#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x306B;&#x5206;&#x985E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4E00;&#x6B21;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x3068;&#x30B0;&#x30EA;&#x30A2;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E; RNAi &#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x306E;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306E;&#x5F62;&#x614B;&#x7684;&#x5F62;&#x8CEA;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x4F4F;&#x30BB;&#x30EB;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x6295;&#x5C04;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x753B;&#x50CF;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x753B;&#x9762;&#x304B;&#x3089;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x5206;&#x6790; 104 &#x306E;&#x9032;&#x5316;&#x7684;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3066;&#x3001;RNAi&#x3001;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; downregulated &#x6E1B;&#x5C11;&#x8EF8;&#x7D22;&#x4F38;&#x5C55;&#x3001;&#x904E;&#x5270;&#x306A;&#x5206;&#x5C90;&#x3001;&#x624B;&#x7B4B;&#x3068;&#x30D6;&#x30EC;&#x30D6;&#x306E;&#x640D;&#x5931;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x5F62;&#x614B;&#x7570;&#x5E38;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x304D;&#x3002;&#x5927;&#x91CF;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x652F;&#x63F4;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x5F62;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D71;&#x8A08;&#x7684;&#x6709;&#x610F;&#x6027;&#x3092;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x753B;&#x50CF;&#x89E3;&#x6790;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B4;&#x30EA;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B4;&#x30EA;&#x30BA;&#x30E0;&#x5206;&#x6790;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0; &#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x753B;&#x50CF;&#x306E;&#x6570;&#x5343;&#x4EBA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x5C06;&#x6765;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x5E83;&#x3044;&#x753B;&#x9762;&#x3067;&#x4E00;&#x6B21;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306B;&#x3068;&#x3063;&#x3066;&#x8CB4;&#x91CD;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x3067;&#x3057;&#x3087;&#x3046;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3067;&#x306F;&#x795E;&#x7D4C;&#x7A81;&#x8D77;&#x4F38;&#x9577;&#x7D30;&#x80DE;&#x9AA8;&#x683C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30FB; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x9175;&#x7D20;&#x5206;&#x5B50;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306A;&#x3069;&#x6A5F;&#x80FD;&#x30AB;&#x30C6;&#x30B4;&#x30EA;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E88;&#x671F;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3001;&#x672C;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x5C0F;&#x80DE;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306E; RNAi &#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;. &#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50; Sec61alpha &#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x862D; GTPase &#x30B7;&#x30E7;&#x30A6;&#x30B8;&#x30E7;&#x30A6;&#x30D0;&#x30A8;&#x80DA;&#x3068;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x80DA;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x5927;&#x8133;&#x76AE;&#x8CEA;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7DCF;&#x79F0;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x7D50;&#x679C;&#x306F; RNAi &#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x306E;&#x4E00;&#x6B21;&#x795E;&#x7D4C;&#x6587;&#x5316;&#x306E; in vivo &#x3067;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x4E26;&#x5217;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x7CFB;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x30EF;&#x30A4;&#x30C9; RNAi &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x795E;&#x7D4C;&#x4F38;&#x9577;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;

&#xC720;&#xC804; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0; &#xB9CE;&#xC740; &#xC720;&#xC804;&#xC790; neurite &#xD30C;&#xC0DD;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xD655;&#xC778;, &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC740; &#xB610;&#xD55C; gastrula, &#xC774;&#xC804; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC774; &#xC788;&#xB294; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xB610;&#xB294; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC811;&#xD569; &#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF4;&#xC0C1; &#xC784;&#xC0B0;&#xBD80; &#xAE30;&#xC5EC; RNA&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC81C;&#xD55C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xCD08;&#xD30C;&#xB9AC; &#xAC8C;&#xB188;&#xC744; RNA &#xAC04;&#xC12D; (RNAi)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD654;&#xBA74; &#xD558; &#xACE0; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xCCAB; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC804;&#xCCB4; &#xAC8C;&#xB188; RNAi &#xD654;&#xBA74; &#xACB0;&#xACFC; &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB193;&#xC5EC;&#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xC774;&#xB77C;&#xB294; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC0F; &#xC720;&#xC804;&#xC790; RNAi &#xC911;&#xC7AC; &#xCD5C;&#xC800;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC751;&#xB2F5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBA85;&#xACFC; &#xD615;&#xD0DC;&#xD559; &#xACE0;&#xAE30;&#xB97C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; &#xC591;&#xC801; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC804;&#xCCB4; &#xAC8C;&#xB188; &#xD654;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; 104 &#xC9C4;&#xD654; &#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC9D1;&#xC911; &#xD558;&#xB294; RNAi&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; downregulated &#xAC10;&#xC18C; &#xCD95; &#xC0AD; &#xD655;&#xC7A5;, &#xACFC;&#xB3C4; &#xD55C; &#xBD84;&#xAE30;, fasciculation, &#xBC0F; blebbing &#xAC19;&#xC740; &#xD615;&#xD0DC;&#xC18C; &#xACB0;&#xD568; &#xC788;&#xC744; &#xB54C;. &#xD070; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC9D1;&#xD569;&#xC758; phenotypic &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC744; &#xB3D5;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;, &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xACE0;&#xAE30;&#xC758; &#xD1B5;&#xACC4;&#xC801; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C; &#xD3C9;&#xAC00;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xBD84;&#xC11D; &#xC54C;&#xACE0;&#xB9AC;&#xC998;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC2EC;&#xC0AC; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xC758; &#xC218;&#xCC9C;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4; &#xC54C;&#xACE0;&#xB9AC;&#xC998;&#xACFC; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC2E0;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBBF8;&#xB798;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xADC0;&#xC911; &#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xAC00; &#xB420; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC2E0;&#xD638; &#xC804;&#xB2EC; &#xBD84;&#xC790;, &#xD6A8;&#xC18C;, &#xCC44;&#xB110;, &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;, &#xBC0F; cytoskeletal &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xBC94;&#xC8FC;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; neurite &#xD30C;&#xC0DD;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xC740;, &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xBC1D;&#xD614;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xC18C;&#xD3EC; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; RNAi &#xACE0;&#xAE30; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAC01;&#xAC01; &#xC720;&#xC804;&#xC790; Sec61alpha &#xBC0F; Ran GTPase &#xCD08;&#xD30C;&#xB9AC; &#xBC30;&#xC544; &#xBC0F; &#xBC30;&#xC544; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xB1CC; &#xD53C; &#xC9C8; &#xC2E0;&#xACBD; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xBC00;&#xB9E4; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACE0;&#xAE30;&#xB97C; &#xD655;&#xC778;. &#xC9D1;&#xB2E8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xB2E4; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC2E0;&#xACBD; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0; RNAi &#xACE0;&#xAE30; vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xAE30;&#xB97C; &#xBCD1;&#xB82C; &#xC218;&#xC640; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC2E0; &#xACBD;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0; &#xB9CE;&#xC740; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC2E0;&#xACBD; &#xAC00;&#xC9C0;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; Rnai&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Aunque pantallas gen&eacute;ticos han identificado muchos genes esenciales para la consecuencia neurita, ellos han sido limitados en su capacidad para identificar genes neuronales que tambi&eacute;n tienen principios cr&iacute;ticos papeles de la g&aacute;strula, o genes neuronales que RNA maternal contribuy&oacute; compensa mutaciones g&eacute;nicas en el zigoto. Para hacer frente a esto, hemos desarrollado m&eacute;todos para pantalla del genoma de Drosophila con interferencia de ARN (RNAi) en las c&eacute;lulas neuronales primarias y presentar los resultados de la primera pantalla de RNAi de genoma completo en las neuronas. Utilizamos im&aacute;genes de c&eacute;lulas vivas y an&aacute;lisis cuantitativo de imagen para caracterizar los fenotipos morfol&oacute;gicos de fluorescencia con neuronas primarias y glia en respuesta a la ca&iacute;da de silenciaci&oacute;n de genes. Desde la pantalla de genoma completo, centramos nuestro an&aacute;lisis en 104 genes evolutivamente conservados que cuando reguladas por RNAi, tienen defectos morfol&oacute;gicos como ax&oacute;n reducida extensi&oacute;n, ramificaci&oacute;n excesiva, p&eacute;rdida de fasciculaci&oacute;n y blebbing. Para ayudar en el an&aacute;lisis fenot&iacute;pico de los grandes conjuntos de datos, generamos algoritmos de an&aacute;lisis de imagen que podr&iacute;an evaluar la significaci&oacute;n estad&iacute;stica de los fenotipos mutantes. Los algoritmos son esenciales para el an&aacute;lisis de las miles de im&aacute;genes generadas por el proceso de selecci&oacute;n y se convertir&aacute; en una herramienta valiosa para futuras pantallas de todo el genoma en neuronas primarias. Nuestro an&aacute;lisis revel&oacute; papeles inesperados, esenciales en consecuencia neurita para genes que representan una amplia gama de categor&iacute;as funcionales, incluyendo se&ntilde;alizaci&oacute;n mol&eacute;culas, enzimas, canales, receptores y prote&iacute;nas citoesquel&eacute;ticas. Tambi&eacute;n encontramos que genes conocidos en prote&iacute;na y trata de ves&iacute;cula mostraron fenotipos similares de RNAi. Confirmamos los fenotipos de la prote&iacute;na trata las neuronas corticales cerebrales genes Sec61alpha y Ran GTPasa utilizando embriones de Drosophila y embrionaria de rat&oacute;n, respectivamente. Colectivamente, nuestros resultados mostraron que fenotipos de RNAi en cultivo primario de nervios pueden paralelo fenotipos en vivo, y la t&eacute;cnica de proyecci&oacute;n puede utilizarse para identificar muchos de los nuevos genes que tienen importantes funciones en el sistema nervioso.

Identificaci&oacute;n de genes de consecuencia neurales con genoma RNAi.

&#x5C0F;&#x5934;&#x7578;&#x5F62;&#x5F71;&#x54CD;&#x5927;&#x7EA6; 1%&#x7684;&#x4EBA;&#x53E3;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E0E;&#x7CBE;&#x795E;&#x53D1;&#x80B2;&#x8FDF;&#x6EDE;&#xFF0C;&#x7535;&#x673A;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#xFF0C;&#x5728;&#x67D0;&#x4E9B;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x7F09;&#x83B7;&#x91CF;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5206;&#x6790;&#x4E86;&#x8111;&#x5927;&#x5C0F;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x4E2D;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x5C0F;&#x5934;&#x7578;&#x5F62;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x6A21;&#x578B;&#x7684;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x78E8;&#x7259;&#x7684;&#x8D2B;&#x8840; () &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x663E;&#x793A;&#x5916;&#x5468;&#x8840;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51CF;&#x5C11;&#x3001; &#x81EA;&#x53D1;&#x975E;&#x6574;&#x500D;&#x4F53;&#x548C;&#x9020;&#x8840;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x80BF;&#x7624;&#x7684;&#x503E;&#x5411;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x7A81;&#x53D8;&#x662F; Cdk5rap2&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5916;&#x663E;&#x5B50; 4 mRNA &#x4ECE;&#x5E27;&#x4E2D;&#x5220;&#x9664;&#x7B2C; 4 &#x5916;&#x663E;&#x5B50;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x53CD;&#x6F14;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x53D1;&#x73B0; CDK5RAP2 &#x4EBA;&#x7C7B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x5F15;&#x8D77;&#x5C0F;&#x5934;&#x7578;&#x5F62;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x63D0;&#x793A; Cdk5rap2(an/an) &#x5C0F;&#x9F20;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8001;&#x9F20;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x5C0F;&#x5934;&#x7578;&#x5F62;&#x5AB2;&#x7F8E;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x75BE;&#x75C5;&#xFF0C;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x649E;&#x51FB;&#x795E;&#x7ECF;&#x6E90;&#x6027;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x5305;&#x62EC;&#x589E;&#x6B96;&#x548C;&#x751F;&#x5B58;&#x4E2D;&#x7684;&#x7F3A;&#x9677;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x3002;Cdk5rap2(an/an) &#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x524D;&#x4F53;&#x63D0;&#x524D;&#x9000;&#x51FA;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5468;&#x671F;&#x548C;&#x8BB8;&#x591A;&#x7ECF;&#x8FC7;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51CB;&#x4EA1;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7F3A;&#x9677;&#x90FD;&#x53D7;&#x635F;&#x7684;&#x6709;&#x4E1D;&#x5206;&#x88C2;&#x7EA7;&#x6570;&#xFF0C;&#x52A0;&#x4E0A;&#x5F02;&#x5E38;&#x7EBA;&#x9524;&#x6781;&#x6570;&#x548C;&#x6709;&#x4E1D;&#x5206;&#x88C2;&#x65B9;&#x5411;&#x4E0E;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x5728; CDK5RAP2 &#x4E2D;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4E0E;&#x89C2;&#x5BDF;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7684;&#x5927;&#x8111;&#x5C3A;&#x5BF8;&#x51CF;&#x5C11;&#x5173;&#x8054;&#x4E0E; centrosomal &#x529F;&#x80FD;&#x53D7;&#x635F;&#x548C;&#x7956;&#x6269;&#x6563;&#x671F;&#x95F4;&#x6709;&#x4E1D;&#x5206;&#x88C2;&#x7684;&#x4E3B;&#x8F74;&#x65B9;&#x5411;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

Cdk5rap2 &#x8C03;&#x8282;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x7956;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x4F53;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x9694;&#x79BB;&#x3002;

Microcephaly affects approximately 1% of the population and is associated with mental retardation, motor defects and, in some cases, seizures. We analyzed the mechanisms underlying brain size determination in a mouse model of human microcephaly. The Hertwig's anemia (an) mutant shows peripheral blood cytopenias, spontaneous aneuploidy and a predisposition to hematopoietic tumors. We found that the an mutation is a genomic inversion of exon 4 of Cdk5rap2, resulting in an in-frame deletion of exon 4 from the mRNA. The finding that CDK5RAP2 human mutations cause microcephaly prompted further analysis of Cdk5rap2(an/an) mice and we demonstrated that these mice exhibit microcephaly comparable to that of the human disease, resulting from striking neurogenic defects that include proliferative and survival defects in neuronal progenitors. Cdk5rap2(an/an) neuronal precursors exit the cell cycle prematurely and many undergo apoptosis. These defects are associated with impaired mitotic progression coupled with abnormal mitotic spindle pole number and mitotic orientation. Our findings suggest that the reduction in brain size observed in humans with mutations in CDK5RAP2 is associated with impaired centrosomal function and with changes in mitotic spindle orientation during progenitor proliferation.

Cdk5rap2 regulates centrosome function and chromosome segregation in neuronal progenitors.

Microc&eacute;phalie affecte environ 1 % de la population et est associ&eacute;e li&eacute;e un retard mental, anomalies moteurs et, dans certains cas, des convulsions. Nous avons analys&eacute; les m&eacute;canismes qui sous-tendent la d&eacute;termination de taille du cerveau dans un mod&egrave;le murin de microc&eacute;phalie humaine. An&eacute;mie de la Hertwig (un) mutant montre du sang p&eacute;riph&eacute;rique cytop&eacute;nies, aneuplo&iuml;die spontan&eacute;e et une pr&eacute;disposition aux tumeurs h&eacute;matopo&iuml;&eacute;tiques. Nous avons constat&eacute; que l&#39;une mutation est une inversion de g&eacute;nomique de l&#39;exon 4 du Cdk5rap2, ce qui entra&icirc;ne une suppression dans le cadre de l&#39;exon 4 de l&#39;ARNm. La conclusion que CDK5RAP2 des mutations humaine cause une microc&eacute;phalie a incit&eacute; davantage analyse des souris Cdk5rap2(an/an) et nous avons d&eacute;montr&eacute; que ces souris pr&eacute;sentent une microc&eacute;phalie comparable &agrave; ce que de la maladie humaine, r&eacute;sultant de la suppression des d&eacute;fauts neurog&egrave;nes qui incluent prolif&eacute;rative et survie d&eacute;fauts dans les cellules souches neuronales. Pr&eacute;curseurs neurones Cdk5rap2(an/an) quitter le cycle cellulaire pr&eacute;matur&eacute;ment et beaucoup subissent l&#39;apoptosis. Ces d&eacute;fauts sont associ&eacute;s &agrave; la progression mitotique avec facult&eacute;s affaiblies, coupl&eacute;e avec le nombre de p&ocirc;les anormale de fuseau mitotique et orientation mitotique. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que la r&eacute;duction de la taille du cerveau observ&eacute;e chez les humains avec des mutations dans CDK5RAP2 est associ&eacute;e avec alt&eacute;ration de la fonction centrosomes et aux changements dans l&#39;orientation du fuseau mitotique au cours de la prolif&eacute;ration des prog&eacute;niteurs.

Cdk5rap2 r&eacute;gule le centrosome fonction chromosome s&eacute;gr&eacute;gation et dans les cellules souches neuronales.

Mikrozephalie betrifft etwa 1 % der Bev&ouml;lkerung und ist verbunden mit Geistesverlangsamung, motor M&auml;ngel und, in einigen F&auml;llen Krampfanf&auml;lle. Wir analysierten die Mechanismen Gehirn Gr&ouml;&szlig;enbestimmung in einem Mausmodell der menschlichen Mikrozephalie. Die Hertwig An&auml;mie (an) Mutant zeigt peripherem Blut Cytopenias, spontane Aneuploidie und eine Pr&auml;disposition zur h&auml;matopoetischen Tumoren. Wir fanden, dass das eine Mutation ist eine genomische Umkehrung von Exon 4 des Cdk5rap2, wodurch eine in-Frame-Deletion von Exon 4 vom mRNA. Die Feststellung, dass die CDK5RAP2 menschliche Mutationen Ursache Mikrozephalie aufgefordert weitere Analyse der Cdk5rap2(an/an) M&auml;use und wir bewiesen, dass diese M&auml;use Mikrozephalie vergleichbar zeigen, dass Fehler der menschlichen Krankheit, infolge der markante neurogene M&auml;ngel, die einschlie&szlig;en proliferative und &Uuml;berleben in neuronalen Vorl&auml;uferzellen. Cdk5rap2(an/an) Neuronale Vorstufen Beenden des Zellzyklus vorzeitig und viele durchmachen Apoptosis. Diese Defekte sind mit gest&ouml;rter mitotische Progression gepaart mit abnormen mitotische Spindel Pol Anzahl und mitotische Orientierung verbunden. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass der R&uuml;ckgang der Gehirngr&ouml;&szlig;e beobachtet bei Menschen mit Mutationen im CDK5RAP2 mit gest&ouml;rter centrosomal Funktion und Ver&auml;nderungen in mitotische Spindel Ausrichtung w&auml;hrend der Stammvater Verbreitung verkn&uuml;pft ist.

Cdk5rap2 regelt Zentrosom Funktion und Chromosome Segregation in neuronalen Vorl&auml;uferzellen.

Microcefalia &egrave; associata a ritardo mentale, difetti motori e, in alcuni casi, crisi epilettiche e colpisce circa l&#39;1% della popolazione. Abbiamo analizzato i meccanismi sottostanti la determinazione dimensione cervello in un modello murino di microcefalia umana. Anemia di Hertwig (un) mutante Mostra sangue periferico citopenie, aneuploidia spontaneo e una predisposizione ai tumori ematopoietici. Abbiamo trovato che l&#39;una mutazione &egrave; un&#39;inversione di genomica dell&#39;esone 4 del Cdk5rap2, risultante in un&#39;eliminazione nella cornice dell&#39;esone 4 da mRNA. La constatazione che CDK5RAP2 umani mutazioni causa microcefalia richiesto ulteriori analisi dei topi Cdk5rap2(an/an) e abbiamo dimostrato che questi topi presentano microcefalia paragonabile a che della malattia umana, derivanti da colpire neurogeno difetti che includono proliferativa e sopravvivenza difetti in progenitori neuronali. Precursori neuronali Cdk5rap2(an/an) uscire prematuramente il ciclo cellulare e molti apoptosi. Questi difetti sono associati con alterata progressione mitotica accoppiato con numero di poli mitotico anormale e orientamento mitotica. I nostri risultati suggeriscono che la riduzione nelle dimensioni del cervello osservati negli esseri umani con mutazioni in CDK5RAP2 &egrave; associata ad alterata funzione centrosomal e con i cambiamenti nell&#39;orientamento del fuso mitotico durante la proliferazione progenitore.

Cdk5rap2 regola la segregazione funzione e cromosoma Centrosoma progenitori neuronali.

&#x5C0F;&#x982D;&#x75C7;&#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x53E3;&#x306E;&#x7D04; 1 &#xFF05; &#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3001;&#x7CBE;&#x795E;&#x9045;&#x6EDE;&#x3001;&#x904B;&#x52D5;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x3068;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B9;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x767A;&#x4F5C;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x5C0F;&#x982D;&#x75C7;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; &#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x8133;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x306E;&#x57FA;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D8;&#x30EB;&#x30C8;&#x30D3;&#x30C3;&#x30D2;&#x8CA7;&#x8840;&#x306F;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x672B;&#x68A2;&#x8840;&#x8840;&#x7403;&#x3001;&#x81EA;&#x767A;&#x7684;&#x7570;&#x6570;&#x6027;&#x9020;&#x8840;&#x5668;&#x816B;&#x760D;&#x306E;&#x7D20;&#x56E0;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3; 4&#x3001;mRNA &#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30D5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x524A;&#x9664;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;Cdk5rap2 &#x306E;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3; 4 &#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x53CD;&#x8EE2;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x767A;&#x898B;&#x306F;&#x3001;CDK5RAP2 &#x30D2;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x5C0F;&#x982D;&#x75C7;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B; Cdk5rap2(an/an) &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;&#x6C42;&#x3081;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x5C0F;&#x982D;&#x75C7;&#x306B;&#x5339;&#x6575;&#x3059;&#x308B;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x75C5;&#x6C17;&#x306E;&#x5897;&#x6B96;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x795E;&#x7D4C;&#x56E0;&#x6027;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x3092;&#x5370;&#x8C61;&#x7684;&#x306A;&#x751F;&#x5B58;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x795E;&#x7D4C;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B20;&#x9665;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;Cdk5rap2(an/an) &#x795E;&#x7D4C;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x7D30;&#x80DE;&#x5468;&#x671F;&#x304C;&#x9014;&#x4E2D;&#x3067;&#x7D42;&#x4E86;&#x3057;&#x3066;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6B20;&#x9665;&#x306F;&#x7570;&#x5E38;&#x306A;&#x6709;&#x7CF8;&#x5206;&#x88C2;&#x7D21;&#x9318;&#x4F53;&#x6975;&#x6570;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x88C2;&#x306E;&#x65B9;&#x5411;&#x3068;&#x76F8;&#x307E;&#x3063;&#x3066;&#x969C;&#x5BB3;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x88C2;&#x306E;&#x9032;&#x884C;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; CDK5RAP2 &#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x8A8D;&#x3081;&#x8133;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x306E;&#x7E2E;&#x5C0F;&#x304C;&#x6709;&#x7CF8;&#x5206;&#x88C2;&#x7D21;&#x9318;&#x4F53;&#x306E;&#x914D;&#x5411;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x5897;&#x6B96;&#x4E2D;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3068; centrosomal &#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x969C;&#x5BB3;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

Cdk5rap2 &#x795E;&#x7D4C;&#x524D;&#x99C6;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x4F53;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x5206;&#x96E2;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Microcephaly &#xC778;&#xAD6C;&#xC758; &#xC57D; 1%&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE58;&#xB294; &#xACE0; &#xC815;&#xC2E0; &#xC9C0;&#xCCB4;, &#xBAA8;&#xD130; &#xACB0;&#xD568; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0;, &#xC5B4;&#xB5A4; &#xACBD;&#xC6B0;&#xC5D0;&#xB294; &#xBC1C;&#xC791;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; microcephaly&#xC758; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xBAA8;&#xB378;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB1CC; &#xD06C;&#xAE30; &#xACB0;&#xC815;&#xC744; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. Hertwig&#xC758; &#xBE48; &#xD608; (&#xD55C;) &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB9D0; &#xCD08; &#xD608;&#xC561; cytopenias, &#xC790;&#xBC1C;&#xC801;&#xC778; &#xC774;&#xC218;&#xC131; &#xC870; &#xD608; &#xC885;&#xC591;&#xC744; &#xD0C0;&#xACE0; &#xB0AC;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC5D1;&#xC190; exon 4&#xB294; Mrna&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xD504;&#xB808;&#xC784;&#xC5D0; &#xC0AD;&#xC81C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB978; cdk5rap2&#xC758; 4&#xC758; &#xAC8C;&#xB188; &#xBC18;&#xC804;. CDK5RAP2 &#xC778;&#xAC04; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC6D0;&#xC778; microcephaly &#xB77C;&#xB294; &#xCD94;&#xAC00; Cdk5rap2(an/an) &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558; &#xACE0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC950; microcephaly&#xB294; &#xC778;&#xAC04; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC758; &#xC99D;&#xC2DD; &#xD3EC;&#xD568; neurogenic &#xACB0;&#xD568;&#xC744; &#xAC15;&#xB82C; &#xD558; &#xACE0; &#xC0DD;&#xC874;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC778; &#xACB0;&#xD568; &#xC2E0;&#xACBD; progenitors&#xC5D0;&#xC11C; &#xBE44;&#xAD50; &#xC804;&#xC2DC; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xCC3E;&#xB294;. Cdk5rap2(an/an) &#xC2E0;&#xACBD; &#xC120;&#xAD6C;&#xC790; &#xC138;&#xD3EC; &#xC8FC;&#xAE30;&#xB97C; &#xC131;&#xAE09; &#xD558; &#xAC8C; &#xC885;&#xB8CC; &#xD558; &#xACE0; &#xB9CE;&#xC740; apoptosis&#xB97C; &#xBC1B; &#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xD568;&#xC740; &#xBE44;&#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; mitotic &#xC2A4;&#xD540; &#xB4E4; &#xADF9; &#xC218;&#xC640; mitotic &#xBC29;&#xD5A5;&#xC744; &#xD568;&#xAED8; &#xC7A5;&#xC560;&#xC778;&#xB41C; mitotic &#xC9C4;&#xD589;&#xC73C;&#xB85C; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; cdk5rap2&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC640; &#xC778;&#xAC04;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xB1CC; &#xD06C;&#xAE30; &#xAC10;&#xC18C; &#xC7A5;&#xC560; centrosomal &#xD568;&#xC218;&#xC640; &#xC870;&#xC0C1; &#xD655;&#xC0B0; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; mitotic &#xC2A4;&#xD540; &#xB4E4; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCC0;&#xD654; &#xAD00;&#xB828; &#xC81C;&#xC548;.

Cdk5rap2 &#xC870;&#xC808; &#xC2E0;&#xACBD; progenitors&#xC5D0;&#xC11C; centrosome &#xAE30;&#xB2A5;&#xACFC; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xBD84;&#xB9AC;.

Microcefalia afecta aproximadamente al 1% de la poblaci&oacute;n y se asocia con el retraso mental, defectos del motores y, en algunos casos, convulsiones. Analizamos los mecanismos subyacentes de la determinaci&oacute;n del tama&ntilde;o del cerebro en un modelo murino de microcefalia humana. Anemia de Hertwig (un) mutante muestra cytopenias de sangre perif&eacute;rica, aneuploid&iacute;a espont&aacute;nea y una predisposici&oacute;n a los tumores hematopoy&eacute;ticos. Encontramos que la una mutaci&oacute;n es una inversi&oacute;n gen&oacute;mica del ex&oacute;n 4 del Cdk5rap2, dando por resultado una canceladura en-marco del ex&oacute;n 4 del mRNA. El hallazgo que CDK5RAP2 mutaciones humano causa microcefalia solicita m&aacute;s an&aacute;lisis de ratones Cdk5rap2(an/an) y hemos demostrado que estos ratones muestran microcefalia comparable a que de la enfermedad humana, resultante de pulso defectos neurog&eacute;nicos que incluyen proliferativa y supervivencia defectos en trasplante de precursores neuronales. Precursores neuronales Cdk5rap2(an/an) salida del ciclo celular prematuramente y muchos sufren apoptosis. Estos defectos se asocian con deteriora progresi&oacute;n mit&oacute;tica juntada con el n&uacute;mero de polos del huso mit&oacute;tico anormal y orientaci&oacute;n mit&oacute;tico. Nuestros resultados sugieren que la reducci&oacute;n en el tama&ntilde;o del cerebro observado en los seres humanos con mutaciones en CDK5RAP2 se asocia con deterioro de la funci&oacute;n se y con cambios en la orientaci&oacute;n del huso mit&oacute;tico durante la proliferaci&oacute;n del progenitor.

Sofia B. Lizarraga

Brown University

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex