Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Riepilogo

Metodi per purificare il colesterolo vincolante tossina streptolisina O ricombinante da E. coli E visualizzazione di tossina legarsi a vivere cellule eucariotiche sono descritti. Erogazione localizzata di tossina induce cambiamenti rapidi e complessi nelle cellule bersaglio che rivelano nuovi aspetti della biologia tossina.

Abstract

Tossine batteriche legano al colesterolo nelle membrane, formando pori che permettono la fuoriuscita di contenuto cellulare e afflusso di materiali dall'ambiente esterno. La cella può recuperare da questo insulto, che richiede processi di riparazione membrane attive, oppure muoiono a seconda della quantità di esposizione tossina e tipo cellulare ^1. Inoltre, queste tossine indurre forti risposte infiammatorie in host infetti attraverso l'attivazione di cellule immunitarie, compresi i macrofagi, che producono una matrice di citochine pro-infiammatorie ^2. Molti batteri Gram-positivi producono colesterolo vincolante tossine che hanno dimostrato di contribuire alla loro virulenza attraverso meccanismi in gran parte non ancora caratterizzati.

Alterazioni morfologiche della membrana plasmatica di cellule esposte a tali tossine includere il sequestro in colesterolo arricchiti protuberanze superficiali, che può essere versato nello spazio extracellulare, suggerendo una difesa intrinseca cellulareMeccanismo ^3,4. Questo processo si verifica in tutte le cellule in assenza di attività metabolica, e possono essere visualizzati utilizzando EM dopo ⁴ chimica fissazione. In cellule immunitarie quali macrofagi che mediano l'infiammazione in risposta all'esposizione tossina, vescicole di membrana indotte sono suggeriti per contenere citochine della famiglia IL-1 e può essere responsabile sia spargimento tossina e diffondere queste citochine pro-infiammatorie ^5,6,7. Un collegamento tra IL-1β rilascio e un tipo specifico di morte cellulare, pyroptosis chiamato è stato suggerito, in quanto entrambi sono processi caspasi-1 ⁸ dipendenti. Per risolvere la complessità di questa risposta dei macrofagi, che comprende vincolante tossina, spargimento di vescicole di membrana, rilascio di citochine, e la morte delle cellule potenzialmente, abbiamo sviluppato le tecniche di etichettatura e metodi di microscopia a fluorescenza che consentono la visualizzazione in tempo reale della tossina cellule interazioni, tra cui misurazioni di disfunzioni e morte (Figura 1). Utilizzaredi imaging cellulare dal vivo è necessario a causa di limiti di altre tecniche. Approcci biochimici non possono risolvere effetti che si verificano in cellule individuali, mentre citofluorimetria non offre alta risoluzione, visualizzazione in tempo reale delle singole celle. I metodi qui descritti possono essere applicati ad analisi cinetica delle risposte indotte da altri stimoli implicano complesse variazioni fenotipiche nelle cellule.

Protocollo

1. Purificazione di streptolisina O (SLO)

1. Inoculare 20 ml di coltura overnight cellule BL21 ORO contenenti plasmide pBADgIII-SLOhis ⁹ in 0,5 L di brodo LB e aggiungere 500 microlitri 50 mg / ml ampicillina. Agitare coltura a 225 rpm a 37 ° C fino a OD ₆₀₀ = 0,6, di solito ~ 1,5 hr. Centrifugare 1 batteri ml (considerato T ₀₎ a 10.000 xg 5 minuti, sciogliere pellet in 140 microlitri 1x tampone campione SDS / 1 OD e sonicare al DNA di taglio per l'analisi delle proteine ​​purezza.
2. Indurre i batteri con l'aggiunta di 5 ml arabinosio 20% alla cultura, agitare a 225 rpm a temperatura ambiente per 3 ore. Raccogliere 1 ml di batteri, centrifugare e sciogliere in 1x tampone campione SDS come sopra, per T _{a 3} punti il tempo per l'analisi della purezza.
3. Raccogliere i batteri rimasti in flacone da 500 ml centrifuga, spin 12.000 xg per 12 min a 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 rotore). Decantare il surnatante, negozio di pellet a -80 ° C per una notte o più a lungo se necessario.
4. Risospendere il frozen pellet su ghiaccio in 10 ml Lyse / tampone di lavaggio (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0) supplementato con 400 microlitri 25% Triton X-100, 100 pl 100 mg / ml lisozima, 50 200 microlitri fenilmetilsulfonil fluoruro mM (PMSF). Trasferire il sedimento risospeso a 50 ml di tubo di Oak Ridge.
5. Sonicare lisato 5 volte per 30 secondi su ghiaccio con intervalli di 30 sec. Spin sonicata lisato in tubo di Oak Ridge a 39000 xg per 20 minuti a 4 ° C (18.000 min Sorvall SS-34 rotore).
6. Mentre il lisato è in rotazione, lavare 1 ml Ni-NTA agarosio con 10 ml Lyse / tampone di lavaggio e centrifugare a 1200 rpm per 5 min a 4 ° C. (Tutti gli altri lavaggi / eluizioni utilizzare la centrifugazione in queste condizioni). Aspirare lavare.
7. Aggiungi surnatante batterica dal punto 1.5 a Ni-NTA agarosio, agitare delicatamente per 2,5 ore a 4 ° C. Spin per raccogliere il supernatante. Unire 30 ml di surnatante con 10 μ 4x tampone campione SDS e risparmiare per l'analisi della purezza. Lavare le perline 4 volte in Lyse / Tampone di lavaggio ece in Tris / sale tampone (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluire 3 volte aggiungendo 1 ml di tampone di eluizione (250 mM imidazolo in tampone Tris / sale buffer) e 5 microlitri 1 M ditiotreitolo (DTT) a perline, incubare su ghiaccio per 10 min, filatura e raccogliere il surnatante. SLO è molto redox-sensibili proteine, e deve essere tenuta in ghiaccio in ogni momento. Una volta ridotta, la proteina si perde rapidamente la sua attività se riscaldato a 37 ° C, anche per un breve periodo di tempo.
9. Lavare 500 pl polimixina-coniugato agarosio in tampone di eluizione, centrifugare a 10.000 xg per 1 min a 4 ° C e risospendere in 500 microlitri. Per esaurire endotossina, aggiungere 200 biglie pl ad ogni eluizione e agitare 4 ° C per 30 min. Centrifuga a 10.000 xg per 1 min a 4 ° C, e salvare il surnatante. Combinare 30 microlitri di ogni eluizione con 10 microlitri 4x tampone campione SDS per analisi SDS-PAGE.
10. Verificare la purezza eluizioni mediante SDS-PAGE. Campioni bollire salvate per analisi di gel a 95 ° C per 5 min e 10 pl di carico su un gel al 10%. Stain gel con Coomassie per visualizzare proteina (Figura 2A). SLO è di 69 kDa. Eseguire un saggio Bradford per determinare la concentrazione della proteina (resa tipica è di 4 mg / ml per i primi due eluizioni, ma può variare da ceppo batterico e plasmide usato).
11. Testare l'attività emolitica di ogni eluizione (vedi sotto). Eluizioni piscina dove l'attività di purezza, concentrazione e emolitica sono soddisfacenti. SLO Aliquotare in monouso aliquote (pl tipicamente 5-10), in ghiaccio secco congelare e conservare a -80 ° C.

2. Saggio emolitica

1. Lavare eritrociti di pecora (RBC) in tampone RBC Assay (0,3% di sieroalbumina bovina (BSA), 2 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugare a 1200 rpm per 5 min, e risospendere al 2,5% in RBC 10 ml tampone del saggio RBC.
2. Aggiungere 10 microlitri tampone di saggio RBC / pozzetto in 96 pozzetti V-parte inferiore piastra su ghiaccio. Serialmente diluire ogni eluizione in duplicato. Campi di diluizione tipici sono 1:1.000 a 1:512,000. Include 3 pozzi senza tossina e 3 pozzi con 10microlitri 2% Triton X-100 come pozzi minimo e massimo, rispettivamente.
3. Coprire la piastra ed incubare a 37 ° C 30 min. Centrifugare a 1200 rpm per 5 min. Trasferire 70 ml di surnatante in un fondo piatto da 96 pozzetti. Leggi A _405. Una unità è la diluizione della tossina necessaria per il 50% di lisi dei globuli rossi. Attività di tossina è 1 unità * diluizione factor/0.01 ml.

3. Cella saggio litico

1. Cellule Harvest, conteggio, spin. Risospendere a 2x10 ⁶ / ml in tampone di R / B (RPMI con 2 mM CaCl _2, 0,5% BSA) e 20 ug / ml di ioduro di propidio. Aggiungere 100 ul di cellule a 96 pozzetti V-piastra inferiore.
2. Diluire serialmente SLO a 2x concentrazione finale in tampone R / B, aggiungere 100 microlitri tossina o 100 microlitri di buffer R / B per le cellule. Incubare 5 min 37 ° C. Distanza tipica finale concentrazioni da 2.000 U / ml a 31,25 U / ml.
3. Eseguire le cellule al citofluorimetro e raccogliere i dati con filtri per ficoeritrina (PE). Un'unica log turno rappresenta cel transitoriamente permeabilizzateLS mentre un 3 turni registro indica le cellule morte ^4. Calcolare la lisi specifica delle cellule sottraendo la percentuale di cellule morte nel controllo (% PI ^alta _ctl) dalla _(exp% PI ^alta) sperimentale, come segue: lisi specifica = (% _exp PI ^alta -% PI ^alta _ctl) / (100 -% PI ^alta _ctl) * 100

4. Micropipetta Consegna di tossina di cellule in coltura

1. Un giorno prima dell'esperimento, piastra 2x10 ⁵ macrofagi in un collagene rivestito con fondo di vetro piastra da 35 mm.
2. Accendere il microscopio e microiniettore. Lasciare il tempo per riscaldarsi fase riscaldata a 37 ° C. La scelta del microscopio dipende di solito su ciò che è localmente disponibile. Il microscopio richiede una fase invertita, una fase in grado di riscaldare i piatti a 37 ° C, eccitazione / emissione cubi filtro appropriato per il colorante scelto, e lo spazio collegare fisicamente il microiniettore. Una lente Bertrandè utile per microiniezione, ma non obbligatorio. Il computer guida il microscopio ha bisogno di memoria sufficiente per raccogliere e memorizzare i dati.
3. Cellule etichette per 30 minuti con la tintura a 37 ° C. A seconda del dosaggio, etichettatura può essere fatto con 5 Fura2 pl AM in 1 ml di PBS o 2 microlitri calceina AM in 1 ml mezzi completi. Per Fura2, eccitazione / emissione viene raccolta per 340/510 nm e 380/510 nm, e il rapporto di 340/380 determina segnali flusso di calcio. Per calceina, eccitazione / emissione è 495/515 nm, mentre etidio omodimero è da 525/620 nm e APC è 650/660 nm. Etichette possono essere scelti altri pure.
4. Lavare le cellule con PBS e posto in 1 ml RPMI supplementato con 2 mM CaCl _2. Montare il microscopio.
5. Diluire tossina e destrano in acqua, e centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C. Tipicamente, 1 pl SLO e 4 microlitri 10 mg / ml destrano-555 viene diluito in acqua 6 microlitri. Destrano fluorescente o un'altra fase fluida molecola viene utilizzato per verificare che il femto-punta non è ostruito, e injects come desiderato.
6. Caricare femto-punta dalla parte posteriore con 0,07 ml di tossina diluito utilizzando un Microloader.
7. Caricare femto-punta su microiniettore. Regolare l'angolo di iniettore in modo che la punta si siede sul centro delle cellule con spazio per muoversi in tutte le direzioni. Cancella z-limite. Impostazioni di iniezione devono essere iniezione per 0,5 secondi a 120 psi a 20 psi di pressione posteriore. Abbassare punta fino a quando non entra nel terreno.
8. Utilizzando la lente di Bertrand, centro della punta e seguire la punta come viene abbassato più vicino alle cellule. Una volta perdere la concentrazione, tornare a ottiche normali. L'ombra ago deve essere evidente nel campo. Concentrarsi sopra le celle e abbassare l'ago finché non è a fuoco. Concentrarsi indietro sulle cellule e accuratamente portare l'ago adiacente a una cella. Impostare il z-limite per l'iniezione. Iniziare immagini, spostare punta nella posizione desiderata, iniettare la tossina di rilasciare al punto di tempo desiderato. Sollevare l'ago, passare a una nuova regione di celle e iniettare. Spostare l'ago alla posizione iniziale per evitare indesiderateperdite tossina dall'ago.

Risultati

Tipicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO può essere ottenuta con una concentrazione proteica di 4 mg / ml. La quantità di tossina necessaria per lisi cellulare varia con il tipo cellulare, ma di solito è 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipi di cellule, come macrofagi può essere più resistenti (4000 U / ml) se altri (linee cellulari T specialmente) sono più sensibili. Queste sensibilità corrispondono SLO disponibile in commercio. Tossina attività diminuisce di circa 2 volte con ogn...

Discussione

Le tecniche qui descritte consentono l'esame delle risposte delle cellule immunitarie di tossine batteriche. La fase più critica è la manipolazione e somministrazione della tossina. Attività tossina può essere estremamente variabile, anche tra differenti aliquote del preparato stesso, per la sua fragilità. Ciò richiede sia la prova di ogni aliquota di tossina contro una linea cellulare di riferimento o globuli rossi o utilizzando gradienti tossina. Gradienti di tossina, come espresso dal micropipetta, permetto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Ni-NTA agarosio	Qiagen	30210
polimixina-agarosio	Sigma	P1411-5ML
Zeba desalt Spin col	Pescatore	PI-89891
globuli rossi di pecora	Pescatore	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	vedi rif 9
Cy5 colorante monoreactive	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM / Ethidium omodimero	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagene rivestito con fondo di vetro piatto	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Pescatore	E5242957000
Microloader	Pescatore	E5242956003
destrano Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Tabella 1. Elenco e fonte di reagenti specifici e equipment necessario. Attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo, insieme con l'azienda e il numero di catalogo sono elencati.
			Buffer Composizione Passo Usato Lyse / lavaggio 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl Imidazolo 10 mM, pH 8,0 1,4 Tris / sale 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 1,7 Tampone di eluizione 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazolo 1,8 RBC Assay Buffer 0,3% BSA 2 mM CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 2,1 buffer di R / B Mezzo di coltura cellulare RPMI 2 mM CaCl 2 0,5% BSA 3.1
			Tabella 2. Lista di buffer utilizzati in questo protocollo. I tamponi usati, la loro composizione e il primo passo in cui sono utilizzati nel protocollo sono elencati.