The Double-H labirinto: una prova comportamentale robusto per l'apprendimento e la memoria nei roditori

Riepilogo

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

Abstract

Ricerca cognizione spaziale nei roditori impiega tipicamente l'uso di compiti labirinto, le cui caratteristiche variano da un labirinto all'altro. Questi compiti variano in base al loro flessibilità comportamentale e durata memoria richiesta, il numero di obiettivi e percorsi, e anche la complessità generale compito. Una caratteristica confusione in molte di queste attività è la mancanza di controllo sulla strategia adottata dai roditori per raggiungere l'obiettivo, ad esempio, allocentrica (procedurali) strategie basate (dichiarative-like) o egocentrici. Il doppio-H labirinto è un compito di memoria di acqua-escape romanzo che risolve questo problema, consentendo lo sperimentatore per dirigere il tipo di strategia appreso durante il periodo di formazione. Il doppio-H labirinto è un dispositivo trasparente, che consiste in un vicolo centrale con tre bracci sporgenti da entrambi i lati, con una piattaforma di fuga sommersa all'estremità di uno di questi bracci.

I ratti possono essere addestrati con una strategia allocentrica alternando la stposizione dell'arte nel labirinto in modo imprevedibile (vedi protocollo 1; §4.7), richiedendo così loro di conoscere la posizione della piattaforma basata sui riferimenti allothetic disponibili. In alternativa, una strategia di apprendimento egocentrica (protocollo 2; §4.8) può essere impiegato rilasciando i ratti dalla stessa posizione durante ogni prova, finché non imparano il modello procedurale necessario per raggiungere l'obiettivo. Questo compito è stato dimostrato per consentire la formazione di tracce di memoria stabili.

La memoria può essere sondato dopo il periodo di formazione in un processo sonda fuorviante, in cui la posizione di partenza per i topi alterna. A seguito di un paradigma dell'apprendimento egocentrica, ratti generalmente ricorrono ad una strategia basata allocentrica-, ma solo quando la loro vista iniziale sui riferimenti extra-labirinto si differenzia nettamente dalla loro posizione originale. Questo compito è ideale per esplorare gli effetti di farmaci / perturbazioni sulle prestazioni della memoria allocentrica / egocentrico, così come le interazioni tra °ese due sistemi di memoria.

Introduzione

Negli animali, l'apprendimento è principalmente mediata dai sistemi hippocampal- e basati striatali di memoria ^1,2, che svolgono un ruolo centrale per quanto riguarda posto- e procedurale memoria, rispettivamente. Il rapporto tra questi due sistemi è complessa, e sono noti per interagire tra loro in modi cooperative o competitive ^1,3. Inoltre, studi hanno dimostrato che l'influenza di uno di questi sistemi di memoria sul comportamento animale può aumentare a seguito dell'assenza o danni dell'altro sistema ^4-7. Entrambi questi sistemi sono collegati alla corteccia prefrontale via talamo.

Numerosi disturbi neurologici e le malattie neurodegenerative possono influenzare cognizione spaziale negli esseri umani, che si basano sull'interazione tra sistemi di memoria procedurale e dichiarativa. Gli esempi includono il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington (HD) ^8-10, il morbo di Alzheimer (AD) ^11-14, nonchéLa sclerosi laterale amiotrofica (SLA) ^15. I modelli animali, che sono rilevanti per questi disturbi possono essere indotte attraverso vari trattamenti farmacologici che bloccano alcuni recettori ^16, così come attraverso le lesioni mirate. Quando tali animali vengono utilizzati con compiti di memoria spaziale, una preziosa può essere acquisita nei meccanismi sottostanti relative a questi disturbi, nonché alle varie opzioni di trattamento.

Ci sono molti diversi tipi di compiti di memoria spaziale nei roditori, che collettivamente sono progettati per valutare gli aspetti specifici di apprendimento e memoria, nonché gli effetti di potenziali trattamenti per vari disturbi ^17,18. Questi compiti possono essere distinti dal numero di obiettivi e percorsi, il grado di flessibilità comportamentale nel risolvere il compito, la durata di memoria o ritardo, così come la scelta della strategia utilizzata per risolvere il compito. Una buona prestazione possono essere acquistate in base a stimoli esterni o punti di riferimento che sono usati per orientarel'animale verso l'obiettivo (una strategia allocentrica o luogo). In alternativa, un roditore può sviluppare una strategia che si basa sulla direzione del corpo e spunti per quanto riguarda la direzione per spostarsi in (una strategia egocentrica o procedurale), ad esempio, se un topo sa che l'obiettivo è un giro sinistra seguita da una svolta a destra , allora c'è poco bisogno di una strategia allocentrico o luogo. Compiti Maze spesso variano a seconda del grado di flessibilità offerto al roditore di risolverli. Ad esempio, nel Morris water maze, una versione a secco di quest'ultimo (per esempio, ¹⁹⁾ o il labirinto Barnes (ad esempio, ^20), ci sono potenzialmente rotte infinite ratto può adottare per raggiungere l'obiettivo. Nel Morris Water Maze, ad esempio, la posizione della porta può essere appreso basato su punti di riferimento o segnali (strategia allocentrico) esterni, o semplicemente nuotare in cerchio verso il centro fino a quando la piattaforma si trova (strategia egocentrica) ^21. Alcuni compiti hanno obiettivi multiplie un alto grado di flessibilità, per esempio il task cono campo ²² o radiale di Olton labirinto ^23. All'altra estremità della scala sono compiti che offrono flessibilità limitata per raggiungere l'obiettivo, ad esempio, il labirinto di pietra, o la versione alternato del T-labirinto. Queste attività forniscono solo un modo corretto di raggiungere l'obiettivo e facilitano l'emergere di routine cognitive che sono principalmente disciplinate dal sistema di memoria procedurale basato striato-.

Il doppio-H labirinto è un dispositivo di test della memoria spaziale romanzo, che è stato progettato per consentire lo sperimentatore di dirigere il tipo di strategia che si impara dai roditori per risolvere il compito ^24. Composto da tre bracci paralleli run intersecate da un vicolo centrale perpendicolare, la doppia H labirinto è un compito d'acqua di fuga in cui i roditori imparano a raggiungere una piattaforma di fuga che è immerso in una delle posizioni labirinto. Durante l'allenamento, una strategia processuale può essere sviluppata mantenendo tlui stesso inizio e sedi in tutto obiettivo. In alternativa, una strategia allocentrica può essere sviluppato alternando la posizione iniziale in un ordine casuale, richiedendo così il ratto di apprendere la posizione della piattaforma nascosta basato su segnali ambientali come deve fare in un labirinto acquatico. Questo risolve un ostacolo presente in molte attività labirinto differenti, in cui lo sperimentatore altrimenti ha poco controllo sul tipo di strategia che utilizzano roditori. Questo è importante se si considera che gli effetti di alcuni farmaci candidati-cognizione migliorare basano sul sistema place-memoria basata ippocampale-, così l'emergere di routine o procedure cognitive può confondere l'interpretazione delle osservazioni comportamentali quando gli animali, ad esempio passare da allocentrica alla memoria procedurale durante il corso di formazione. Allo stesso modo, può essere desiderabile per valutare gli effetti dei farmaci e trattamenti su memoria procedurale, senza l'influenza della memoria posto a base allocentrica. Infine, questo dispositivopuò essere utilizzata per studiare le interazioni cooperative o competitive tra questi sistemi di memoria, e le condizioni in cui i roditori possono passare da un sistema all'altro.

Protocollo

1. Considerazioni generali

Questo protocollo è approvato dalla cura e l'uso di animali Comitato University Hospital Friburgo (lo stesso per Strasburgo). L'acuità visiva è necessaria per le prestazioni nei test di apprendimento spaziale. I roditori con sistemi di visione ridotta non sono idonee. Inoltre, l'illuminazione deve essere sufficiente in modo che i topi per vedere i diversi spunti situati sulle pareti circostanti. E 'utile utilizzare spunti (quadrato, cerchio, triangolo) a forma di base ma ben contrastate (ad esempio, segnali a vernice nera su uno sfondo dipinto di bianco). Allo stesso modo, gravi deficit motorie sono criteri di esclusione, perché è necessaria nuoto per questo test e annegamento possono verificarsi. Infine, roditori iper-ansiosa in grado di visualizzare un comportamento di ricerca fortemente sbilanciata, che incide sulle prestazioni.

2. Apparato Set Up

1. Costruire un labirinto doppio H costituito da un vicolo centrale 160 cm, che si interseca ad entrambe le estremità e nel centroda tre bracci paralleli eseguire 160 centimetri (vedi Figura 1). Assicurarsi che il vicolo centrale e le sue perpendicolari braccia sono larghe 20 centimetri, e sono circondati di 35 cm di altezza pareti in plexiglass trasparente. Spessore del plexiglas è di 6 mm per tutte le parti.
2. Fissare le pareti in luogo utilizzando colla e viti, e impermeabile il labirinto con giunti in silicone a tutti gli angoli interni. Questi giunti possono essere sostituiti facilmente dovrebbero perdere la loro impermeabilità. Inserire un foro di scarico all'estremità di uno dei bracci angolari (o nel mezzo del labirinto) per lo svuotamento.
3. Posizionare il labirinto in un 80 cm di altezza tavolo, con uno spazio adeguato intorno ad esso per a) passeggiare per il labirinto, e b) il deposito di spunti ben contrastate. Designare ogni braccio nel labirinto dalla sua posizione, vale a dire, nord-ovest (NW), a nord (N), nord-est (NE), sud-ovest (SW), sud (S), e sud-est (SE).
4. Posizionare una telecamera montata a soffitto sopra il labirinto per l'analisi post-test del comportamento animale, con manuale o aut(Video-tracking) metodi OMATIC (vedi § 5).

3. Osservazioni generali

1. Prima dell'uso, riempire il labirinto con acqua ad un'altezza di circa 18 centimetri (200 L). Questo è abbastanza alta per impedire che i topi di toccare il fondo del labirinto con i piedi, ma sufficiente per evitare la fuga superficiale.
2. Dopo la pre-formazione, rendere l'opaca acqua mescolando 250 g di latte scremato in polvere. Cambiare l'acqua ogni giorno per evitare che il latte-acqua dal diventare rancido. Mantenere la temperatura dell'acqua tra 21 - 23 ° C per fornire incentivo per i topi a cercare la piattaforma di fuga.
   NOTA: Come ratti diventano conoscenza della posizione della piattaforma durante la pre-formazione, la sua posizione viene spostata ad un braccio differente durante l'allenamento.
3. Prima dell'uso, immergere un cm 10 piattaforma alto 17 cm di diametro all'estremità di uno dei bracci angolari (NE, NW, SE o SW). Garantire l'altezza per essere sommersa è di 1 cm sotto la superficie della superficie dell'acqua. Formare i ratti per raggiungerela piattaforma di destinazione utilizzando un allocentrica o strategia di apprendimento egocentrica, che dipende dal tipo di paradigma utilizzato (vedi § 4).

4. Protocolli di formazione di base

NOTA: I ratti sono in genere dotati di un primo giorno di pre-formazione, che permette loro di familiarizzare con il labirinto.

1. Per pre-formazione rilasciare il ratto dall'estremità di uno dei bracci centrali (ad esempio, il braccio S) e posizionare la piattaforma porta all'estremità di uno dei bracci angolari (ad esempio, NE), quindi invia i ratti 4 consecutive 60 sec prove in cui per raggiungere la piattaforma di destinazione.
2. Raggiunta la piattaforma di fuga, permettono il ratto di aspettare lì per 15 secondi, in modo che possano riposare e osservare l'ambiente circostante. Indipendentemente dalla posizione iniziale, bloccare sempre il braccio opposto con una porta a ghigliottina trasparente, che impedisce l'ingresso.
   NOTA: Durante la pre-formazione, lasciare l'acqua trasparente e regolare la piattaforma cheight tale che sporga 1 cm sopra la superficie dell'acqua, rendendo così visibile al ratto.
3. Eseguire allenamento quotidiano costituito da un massimo di 4 prove consecutive, separate da uno spazio 10 sec almeno (formazione discreta, cioè, con intervalli di diversi minuti tra le prove, è un'alternativa).
4. Per la formazione, riposizionare la piattaforma dalla sua posizione di pre-formazione al braccio prescelto (ad esempio, NW), e immergerla alla sua estremità 1 cm sotto la superficie dell'acqua. Ora rendere l'opaca acqua con l'aggiunta di latte di potere e di eseguire la seguente formazione (sezione 4).
5. Per i ratti che non raggiungono la piattaforma di destinazione entro 60 sec, loro ritornano alla posizione di partenza, e delicatamente li guidano alla piattaforma dallo sperimentatore.
6. Misurare diverse variabili durante le sessioni di formazione e sonda, come, distanza nuotato, latenza braccio porta / piattaforma, il tempo trascorso in ogni braccio, così come il numero di errori iniziali / ripetitive (vedere Figura2). Tenete a mente che latenze possono essere influenzati da difficoltà motorie. Se la si verificasse, la distanza e gli errori appaiono come variabili più affidabili per quanto riguarda le prestazioni cognitive.
7. Allocentrica Training Strategy:
   1. 1 ° giorno - Pre-Training:
      1. Non aggiungere il latte in polvere per questo passo. Posizionare piattaforma fuga sporgente 1 cm sopra la superficie dell'acqua in una posizione fissa. Ratti treno in 4 prove consecutive per raggiungere la piattaforma.
   2. Giorni 2-5 - Formazione:
      1. Aggiungere 250 g di latte scremato in polvere in acqua per renderla opaca. Spostare la piattaforma ad un braccio diverso (ad esempio, da NE a NW) e aggiungere acqua in modo che la piattaforma è di 1 cm sotto la superficie dell'acqua. Ratti di uscita da entrambi braccio N o S in sequenze imprevedibili per ogni sessione, in modo che entrambe le braccia sono utilizzati due volte come inizio di prova in una sola seduta (4 prove / giorno, per esempio, SNNS, NSNS; vedi figura 3).
   3. Giorno 6 - Sonda Sessione:
      1. Rimuovere la piattaforma per il processo sonda. Rilasciare ratti da un braccio di diverso a quelli utilizzati durante l'allenamento (ad esempio, SW), e permettere loro di nuotare per 60 sec. Vedere la Figura 4 per le tracce di nuoto rappresentativi. Analisi del tempo trascorso nel braccio di destinazione (ex posizione della piattaforma) fornisce un'indicazione sul fatto ratti utilizzano una strategia spaziale, un altro tipo di strategia, una combinazione sequenziale di differenti strategie (vedi sotto), o un modello di ricerca disorganizzato.
8. Training Strategy Egocentric:
   1. 1 ° giorno - Pre-Training:
      1. Questo è lo stesso come il primo passo nella formazione strategia allocentrico (passo 4.1). Non aggiungere il latte in polvere per questo passo. Posizionare piattaforma fuga sporgente 1 cm sopra la superficie dell'acqua in una posizione fissa. Ratti treno in 4 prove consecutive per raggiungere la piattaforma.
   2. Giorni 2-5 - Formazione:
      1. Aggiungere 250 g dilatte scremato in polvere in acqua per renderla opaca. Spostare la piattaforma ad un braccio diverso e aggiungere acqua in modo che la piattaforma è 1 cm sotto la superficie dell'acqua. Ratti di uscita dello stesso braccio di partenza (S o N; vedi Figura 5) per ogni prova (4 prove / giorno).
   3. Giorno 6 - Sonda Sessione:
      1. Rimuovere la piattaforma per il processo sonda. I ratti sono liberati da un braccio diverso da dove sono stati rilasciati durante la formazione. Lasciare i ratti di nuotare per 60 sec. Bloccare il braccio opposto con una porta a ghigliottina trasparente.
         NOTA: Modificare le strategie di formazione di cui sopra per in base alle esigenze del particolare esperimento, ad esempio, effetti di prova della droga, ecc.
9. Asciugare il ratto fuori con asciugamani assorbente dopo ogni sessione in acqua.

5. Analisi

1. Eseguire misure di latenze, errori iniziali e ripetitivi, prime scelte e il tipo di risposta Manually registrando queste variabili dai video ripresi dalla telecamera dall'alto.
2. In alternativa, se disponibile, utilizzare disponibile in commercio software video-monitoraggio e configurati per registrare queste variabili automaticamente.
3. Analisi Statistica:
   NOTA: La specifica implementazione di analisi statistica dipende lo studio, che si sta svolgendo.
   1. Eseguire un uno, due o tre vie ANOVA per quanto riguarda gli errori iniziali / ripetitivi, la latenza di rete del braccio / piattaforma, e il tempo trascorso nel braccio di destinazione; con fattori che includono il giorno del test, e gruppo di trattamento (s).
   2. Se necessario, procedere con ANOVA post hoc-Newman-Keuls confronti multipli prove. Per confrontare le prestazioni, utilizzare un valore di riferimento (ad esempio, il tempo trascorso nel braccio bersaglio durante una prova della sonda rispetto al livello di probabilità), ed eseguire il test t.
   3. Se necessario, utilizzare le statistiche non parametriche in aggiunta (per esempio, χ², vedi sotto) o invece quando le condizioni per parametquelli ric non sono soddisfatte.

Risultati

Egocentric strategia di apprendimento

Uno studio è stato condotto per determinare se la strategia di memoria scelto ratti modifiche in base alle alterazioni della loro prospettiva di stimoli ambientali esterni, seguendo un paradigma egocentrica-learning ^25. I ratti sono stati formati in 4 giorni (4 prove / giorno) per raggiungere un braccio obiettivo situato a NE, e sono stati successivamente testati il quinto giorno utilizzando un processo sonda fuorviante, in cui il braccio parten...

Discussione

Commenti su Studio Progettazione e analisi

Fin dalla sua creazione, la doppia H labirinto è stato utilizzato in una serie di esperimenti comportamentali nei ratti, che insieme sono stati progettati per studiare le risposte egocentriche e / o allocentrica nei ratti in condizioni normali ^24,25 e alterato ^26-29 stati cerebrali. Gli ultimi studi includono striato stimolazione cerebrale profonda (DBS) ^26, modelli animali di disturbi neurologici ^27,28, cos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats or Mice	Charles River
Towels for drying	University Hospital		1 / animal
Water			~200 L / day
Skim milk powder	Grocery store		250 g / 200 L water
Garden Hose	Hardware store
Drying rack for towels	Hardware store
Kinect camera	Kinect
PC computer	any
[header]
Double H Maze, (plexiglass) (Custom-Built)
External lateral walls, 1600 × 350 × 6 mm			2
Internal lateral walls, 706 × 350 × 6 mm			8
Central corridor panels, 500 × 350 × 6 mm			4
Arm extremities, 188 × 350 × 6 mm			6
Guillotine doors, 187 × 350 × 6 mm			3
Extremity covers, 200 × 250 mm			6
Crossbars, 200 × 40 mm			6
[header]
Double-H Maze Platform (to be ballasted) (Custom-Built)
Metal platform, 100 mm diameter × 150 mm			2
Platform cover, 100 mm diameter × 6 mm			2