Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

Riepilogo

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Abstract

Il recente sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) ha dimostrato che le cellule somatiche mature possono tornare a una, stato pluripotente indifferenziata. Ora, riprogrammazione avviene con vari tipi di cellule somatiche adulte: cheratinociti, cellule urina, fibroblasti, ecc I primi esperimenti erano solitamente fatto con fibroblasti dermici. Tuttavia, questo richiede una procedura chirurgica invasiva per ottenere fibroblasti da pazienti. Pertanto, cellule in sospensione, come le cellule del sangue e delle urine, sono stati considerati ideali per la riprogrammazione causa della convenienza di ottenere le cellule primarie. Qui, riportiamo un protocollo efficace per la generazione di IPSC dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Con placcatura le PBMC trasdotte in serie ad un nuovo, piastra con centrifugazione a matrice rivestita, questo protocollo può fornire facilmente colonie IPSC. Questo metodo è applicabile anche per le cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale (CBMCs). Questo studio presenta un prot semplice ed efficienteOcol per la riprogrammazione di PBMC e CBMCs.

Introduzione

Le cellule staminali sono stati uno dei materiali più interessanti nella terapia clinica per gli ultimi decenni ^1. Le proprietà interessanti di cellule staminali sono pluripotenza e la capacità di auto-rinnovarsi. Nel 1981, le prime cellule staminali embrionali (ESC) sono stati isolati dal embrione di topo ^2. Tuttavia, quando la tecnica è stata applicata agli embrioni umani, ha affrontato diverse questioni etiche.

Nel 2006, quando il dottor Yamanaka e il suo team riprogrammate la prima cella pluripotenti da cellule somatiche del mouse, il campo delle cellule staminali ha riguadagnato la sua possibilità e l'interesse si è riaccesa ^3. Offrendo diversi fattori definite, cellule staminali pluripotenti sono state con successo "indotte" dalle cellule somatiche adulte, e furono così chiamati "cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)." Nel 2007, questa tecnica è stata applicata a cellule umane ^4, cedendo le cellule con le caratteristiche esatte della CES, ma nessuno del dibattito etico. Teoricamente, iPSCs può essere generato da qualsiasi tipo cellulare ottenuta da qualsiasi individuo o paziente. iPSCs paziente-specifici sono in aumento come un potenziale strumento in grado di simulare i fenotipi di malattia e le condizioni epigenetici di ogni singolo paziente. Usando la modifica del gene o altri metodi che possono invertire la condizione patogena, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati anche in medicina personalizzata ^5. Inoltre, iPSCs sono meno associati con rigetto immunitario perché hanno la stessa identità immunitario come il donatore, rendendo l'auto-trapianto più fattibile ^6. Pertanto, iPSCs sono diventate la piattaforma più promettente nella modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie rigenerative. Alla luce di questi vantaggi, protocolli migliorati che possono dare più puro e rendimenti più elevati nel minor tempo possibile dalla sorgente più piccola cellula sono costantemente in fase di sviluppo. Una considerazione importante di trovare il protocollo più efficiente per applicazioni future è il tipo di cellula primaria. La maggior parte della prima generazione proto iPSCCols sono ottimizzati per cellule aderenti dal momento che le linee originali IPSC sono state indotte da fibroblasti cutanei ^4. Tuttavia, l'isolamento e la preparazione di queste cellule sono lavoro intensivo. Inoltre, l'isolamento di fibroblasti cutanei comprende procedure chirurgiche invasive che possono diventare una grave lacuna per la più ampia applicazione.

Pertanto, per l'ulteriore uso di iPSCs, è necessaria una fonte cella con acquisizione conveniente. Il sangue è considerato come fonte di cellule ideale in quanto ottenuto attraverso una procedura piuttosto minimamente invasiva ^7-9. In questo studio, abbiamo sviluppato una semplice modifica al protocollo generare hiPSCs da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Senza il difficile processo di espansione di un tipo di cellula specifica, come le cellule CD34 +, le cellule del sangue intero o PBMC sono stati in serie placcato su piastre rivestite di matrice per centrifugazione dopo trasduzione con il virus di Sendai contenente fattori Yamanaka. Questo metodo riduce il tempo richiesto per lal'attaccamento delle cellule galleggianti trasdotte e diminuito la perdita di cellule riprogrammate che non erano in grado di collegare in proprio.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861).

1. Isolamento dei monociti cellule dal sangue

1. L'isolamento di cellule monociti (Giorno -5)
   1. Ottenere almeno 10 ml di sangue fresco da un prelievo di sangue in un tubo preparato cellulare (CPT).
   2. Trasferire il sangue in una nuova provetta conica da 50 ml e diluire con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto 1: 4.
      NOTA: un più alto rapporto di diluizione può essere utilizzato per una maggiore purezza.
   3. Aggiungere 10 ml di media gradiente di densità in una nuova provetta conica da 50 ml e strato attentamente il sangue diluito in cima media gradiente di densità. Centrifugare a 750 xg per 30 min a temperatura ambiente (RT) senza freno centrifugazione.
   4. Trasferire accuratamente lo strato di buffy ad un nuovo tubo conico da 50 ml, aggiungere 30 ml di PBS al tubo, e lavare le cellule.
   5. Centrifugare le cellule a 515 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Eliminare il PBS e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue.
   7. Contare le cellule e piastra 1 x 10 ⁶ cellule per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere PBS ai pozzetti circostanti per evitare l'evaporazione.
   8. Stabilizzare le cellule per 5 giorni a 37 ° C in 5% CO ₂ prima trasduzione. Aggiungere un ulteriore 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue fresco nelle giornate 3-4 senza disturbare le cellule.

2. trasduzione da Sendai virus

1. Trasduzione (giorno 0)
   1. Raccogliere e trasferire le cellule del sangue ad un tubo conico da 15 ml e contarli con un emocitometro.
   2. Preparare 3 x 10 ⁵ cellule per trasduzione e centrifugare le cellule a 515 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzi di cellule del sangue.
   4. Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra non rivestiti 24 pozzetti.
   5. Scongelare la miscela di virus di Sendai in ghiaccio e aggiungerlo al SUcellule trascorsa. Aggiungere Sendai virus alle cellule in base alle raccomandazioni del produttore.
   6. Sigillare la piastra con un film di sigillatura e centrifugare a 1150 xg per 30 min a 30 ° C.
   7. Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO ₂ overnight (O / N).
2. trasferimento di cellule di matrice alimentatore (1 ° giorno)
   1. Il giorno successivo, il cappotto di un 24-pozzetti con vitronectina. Diluire la soluzione vitronectin in PBS per una concentrazione finale 5 mg / ml. Aggiungere 1 ml di vitronectina in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Rimuovere la soluzione di rivestimento prima dell'uso. piastre rivestite possono essere memorizzati in RT per 3 giorni.
   2. Trasferire tutti i supporti contenenti le cellule e virus al rivestito bene.
   3. Raccogliere le cellule rimanenti con l'aggiunta di 0,5 ml di mezzi delle cellule del sangue fresco e aggiungerlo alla cella contenente bene.
   4. Centrifugare la piastra a 1.150 xg per 10 min a 35 ° C.
   5. dopo centorifugation, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di IPSC dei media, e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% di CO ₂ O / N.
3. In secondo luogo il trasferimento di cellule (2 ° giorno)
   1. Coat pozzetti di una nuova 24-pozzetti con 5 mg / ml vitronectina, come descritto al punto 2.2.1. Utilizzare uno pozzetto della piastra per ogni trasduzione.
   2. Trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla piastra vitronectina appena rivestito.
      NOTA: se non necessario, cellule in sospensione possono essere scartati. La procedura di cui al punto 2.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le celle di sospensione. Se si ripeteranno i passi, raccogliere le cellule.
   3. Nel frattempo, aggiungere 1 ml di COPSI media per pozzo della prima piastra, per la manutenzione e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   4. Mantenere le cellule attaccate a 37 ° C e 5% CO ₂ ed eseguire un cambiamento supporto quotidiano con mezzi COPSI fresco. Le colonie appariranno nei giorni 14-21 dopo trasduzione.
   5. Centrifuge la piastra appena rivestito contenente le celle di sospensione a 1.150 xg e 35 ° C per 10 min.
   6. Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   7. Il giorno successivo, rimuovere il surnatante e sostituirlo con i media IPSC freschi.
      NOTA: La procedura di cui al punto 2.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le cellule di sospensione. Se si ripeteranno i passi, raccogliere le cellule del surnatante e ripetere il punto 2.3.
   8. Mantenere le cellule attaccate con i cambiamenti dei media al giorno fino a raggiungere l'80% di confluenza.

3. Manutenzione delle cellule riprogrammato

1. manutenzione anticipata dopo la cultura 24-pozzetti
   1. 7-10 giorni dopo la trasduzione, una volta che le cellule sono confluenti, preparare una, piatto vitronectina in acciaio 60 mm. Diluire soluzione vitronectina in PBS per una concentrazione finale 5 mg / ml. Aggiungere 1 ml di vitronectina al piatto ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   2. lava ilcellule con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule.
   3. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 2 min.
   4. Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg ed RT per 2 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di mezzi freschi IPSC.
   5. Piastra tutte le cellule risospese sulla nuova rivestito piatto di 60 mm.
   6. Aggiungere 10 mM chinasi RHO alle cellule e mantenerli a 37 ° C in 5% CO ₂ fino a quando le cellule sono 80% confluenti.
2. Spalato per l'aspetto delle colonie (Subclonaggio Preparazione)
   1. Preparare una, piatto vitronectina rivestite da 100 mm, come descritto al punto 3.1.2.
   2. Lavare le cellule con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule.
   3. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 2 min.
   4. Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg ed RT per 2 min.
   5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare 1 x 10 ⁴ cellule per piatto.
   6. Centrifugare le cellule a 250 xg ed RT per 2 min.
   7. Risospendere 1 x 10 ⁴ cellule in 6 ml di IPSC mezzi, li piatto sulla rivestito piatto da 100 mm, e aggiungere 10 inibitore della chinasi mM RHO ai media.
   8. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO ₂ per una settimana finché appaiono grandi colonie.
      NOTA: Mantenere e ampliare le colonie per subcloning. Subcloning di solito è fatto in meno di 5 passaggi.
3. Colony raccolta utilizzando iPSC colonia distacco soluzione
   1. Una settimana prima colonia di raccolta, di semi di 1 x 10 ⁴ cellule in un piatto vitronectina rivestite da 100 mm, come indicato al punto 3.2.7.
   2. Preparare un piatto vitronectina rivestito 60 mm aggiungendo 2 ml di soluzione di vitronectina e incubando a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
   3. Osservando al microscopio (40x o ingrandimento 100X), marcare colonie con chiari confini con un pennarello. Rimuovere la soluzione vitronectin dalla nuova piastra realizzato in fase 3.3.2 e aggiungere 6 mldi IPSC multimediale integrato con 10 mM RHO chinasi.
   4. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavare con 3 ml di PBS.
   5. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco iPSC colonia e incubare per 30 s a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere la soluzione dalla piastra ed incubare a temperatura ambiente per altri 30 sec.
   7. Usando una pipetta P200, disegnare 200 ml di mezzi dalla piastra e staccare le colonie mirati pipettando. Trasferire le colonie sparse per il nuovo piatto da 100 mm.
   8. Incubare e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO _2.
      NOTA: Dopo aver ottenuto un puro colonie IPSC, le cellule sono state mantenute fino a raggiungere il passaggio 10. La caratterizzazione è stata fatta dopo almeno 10 passaggi. Diluizioni Anticorpo e informazioni di primer sono riportati nelle tabelle 1 e 2.

Risultati

Questo protocollo presenta un metodo semplice per riprogrammare PBMC isolate da sangue. Utilizzando la combinazione di rivestimento di serie e centrifugazione, iPSCs sono stati generati con successo. Con questo metodo, iPSCs potrebbero essere generati con una piccola quantità di cellule di sangue intero senza isolare o espandere un tipo di cellula specifico. Abbiamo generato con successo iPSCs da solo 1x10 ⁴ celle in una piccola piastra di coltura cellulare.

Discussione

Dal momento che le cellule staminali embrionali (CSE) hanno evidenziato diverse lacune, è stato richiesto l'esigenza di uno strumento alternativo. Pertanto, lo sviluppo delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da Yamanaka è venuto sotto i riflettori internazionali. E 'stato quasi un decennio da quando Yamanaka ha scoperto che pluripotenza può essere indotta con l'aggiunta di soli quattro geni nelle cellule somatiche adulte. Dal momento che iPSCs sono "indotte" dalle cellule somatiche...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer