Combinando analisi SDS-PAGE non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura

Summary

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Un metodo semplice per analizzare complessi multimerici stabilizzati da questi legami è attraverso l'analisi di SDS-PAGE non-riduzione. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l'isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma dell'osso umano U-2 OS.

Abstract

Le strutture di molte proteine sono stabilizzate attraverso legami di disolfuro covalenti. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traduzionale. Così, è importante essere in grado di studiare questa modifica nelle cellule viventi. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso un metodo a due fasi di analisi SDS-PAGE non-riduzione e cross-linking di formaldeide. Questo metodo a due fasi è vantaggioso come il primo passo per scoprire complessi multimerici stabilizzati da legami disolfuro a causa della sua facilità tecnica e basso costo di funzionamento. Qui, la linea cellulare di osteosarcoma osseo umano U-2 OS viene utilizzata per illustrare questo metodo analizzando specificamente l'isoforma nucleare di dUTPase.

Introduction

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traslazionale reversibile, agendo come un "interruttore redox" a base di cisteina che consente la modulazione della funzione proteica, la posizione e l'interazione^{1,2, 3,4}. Pertanto, è importante essere in grado di studiare questa modifica. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso l'analisi non-riduzione SDS-PAGE⁵. L'analisi SDS-PAGE è una tecnica utilizzata in molti laboratori, dove i risultati possono essere ottenuti e interpretati in modo rapido, semplice e con costi minimi, ed è vantaggioso rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i legami disolfuro come la spettrometria di massa^{6 ,7} e dicroismo circolare⁸.

Un passo importante nel determinare se questo metodo è una tecnica appropriata per aiutare in uno studio è quello di esaminare accuratamente la sequenza primaria della proteina di interesse per assicurare che ci sono residui di cisteina (s) presenti. Un altro passo utile è quello di ricercare le precedenti strutture cristalline pubblicate o utilizzare un'applicazione bioinformatica per esplorare la struttura tridimensionale della proteina di interesse per visualizzare dove possono essere localizzati i residui di cisteina. Se il residuo (s) è presente sulla superficie esterna può essere un candidato migliore per formare un legame disolfuro piuttosto che un residuo di cisteina sepolto all'interno della struttura. Tuttavia, è importante notare che le proteine possono subire cambiamenti strutturali sulle interazioni del substrato o sulle interazioni proteina-proteina permettendo che questi residui diventino poi esposti anche all'ambiente.

I complessi multimerici identificati possono quindi essere verificati con il cross-linking chimico usando la formaldeide. La formaldeide è un cross-linker ideale per questa tecnica di verifica a causa dell'elevata permeabilità alle cellule e della breve estensione di ~ 2-3 Å, assicurando il rilevamento di interazioni proteina-proteina specifiche^9,10. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l'isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma ossea umana U-2 OS¹¹. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per altre linee cellulari, tessuti e organismi.

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Protocol

1. blocco dei residui di cisteina liberi utilizzando iodoacetamide

1. Crescere le cellule U-2 OS in un 6 cm² piatto al 50%-60% confluenza in mezzo essenziale minimo con alto glucosio contenente 10% siero bovino fetale e 1% piruvato di sodio a 37 ° c in 5% Co₂.
2. Fare un nuovo stock di 10 mM iodoacetamide appena prima dell'uso, quindi scartare il reagente non utilizzato.
3. Aggiungere 0,1 mM di concentrazione finale iodoacetamide direttamente al supporto di coltura cellulare. Delicatamente la pietanza a temperatura ambiente per 2 min.

2. raccolta delle cellule

1. Aspirare il supporto dalle cellule.
2. Lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina tampone al fosfato freddo (PBS) tre volte. Aspirare la soluzione finale di lavaggio PBS poi aggiungere 1 mL di PBS freddo.
3. Raschiare le cellule dal fondo del piatto usando un raschietto cellulare. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
4. Girare le cellule a 7.500 x g per tre min a 4 ° c. Aspirare il PBS, lasciando dietro il pellet cellulare. Il pellet cellulare può essere conservato a-80 ° c fino all'elaborazione

3. estrazione di proteine

1. Preparare 100 μL di tampone di lisi 1x diluito in ddH₂O (vedere tabella dei materiali). Aggiungere il fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM.
2. Aggiungere 50 μL di tampone di lisi 1x direttamente al pellet cellulare e sospendere. Incubare questo su ghiaccio per 5 min.
3. Sonicare per 8 s utilizzando la modalità a impulsi costante a 40% (vedere tabella dei materiali per SONICATOR; regolare come necessario per i diversi sonicators), mantenendo l'estratto sul ghiaccio.
4. Girare l'estratto a 4 ° c per 5 min a 16.000 x g. Il supernatante è la frazione proteica solubile. L'analisi di Bradford può essere eseguita per determinare la concentrazione proteica se lo si desidera.

4. preparazione del campione

1. Prenda 10 μL dell'estratto proteico solubile e aggiunga 10 μL di un tampone di campionamento di 1 Laemmli SDS (4% SDS, 20% glicerolo, 0,004% di bromopfenolo e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Non aggiungere alcun reagente riducente.
2. Conservare i campioni su ghiaccio se l'analisi SDS PAGE verrà eseguita quel giorno; per lo stoccaggio a lungo termine,-20 ° c è appropriato. A destra prima di eseguire il gel, riscaldare il campione per 5 minuti a 85 ° c.

5. in vivo formaldeide cross-linking delle proteine endogene nelle cellule OS U-2

1. Far crescere le cellule U-2 OS in un 175 cm² Flask al 70% – 80% confluenza (vedere paragrafo 1).
2. Eseguire la reazione di reticolazione della formaldeide
   1. In una cappa di fumi, aliquota una soluzione di formaldeide 37% acquistata da fonti commerciali. Aggiungere il fissativo di formaldeide direttamente al mezzo ad una concentrazione finale dell'1% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min.
   2. Per placare la reazione, aggiungere 1,25 M di glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata su un bilanciere per 5 min.
3. Lavare le cellule con 5 mL di PBS freddo tre volte. Aspirare la soluzione finale di lavaggio PBS e aggiungere 10 mL di PBS. Raschiare le cellule dal fondo del pallone usando un raschietto cellulare.
4. Utilizzando una pipetta da 10 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Girare le cellule a 500 x g per 2 min a 4 ° c. Aspirare il PBS, lasciando dietro il pellet cellulare.

6. frazione dei nuclei

1. Preparare 10 mL di tampone di omogeneizzazione: 0,25 M saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES e 0,5% BSA a pH 7,4. Aggiungere PMSF immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM e 3 ml di tampone di sospensione dei nuclei (0,1% Triton X-100 in PBS).
2. Aggiungere 5 mL di omogeneizzazione tampone direttamente al pellet cellulare e sospendere completamente. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 2 min a 4 ° c, quindi gettare il surnatante.
3. Sospendere il pellet in 5 mL di tampone di omogeneizzazione. Utilizzare un omogeneizzatore di vetro-teflon aderente, Dounce omogeneizzare le cellule a 10 colpi/500 rpm.
4. Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 10 min a 4 ° c, quindi scartare il supernatante.
   Nota: Utilizzare il supernatante per l'isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione a 10.000 x g per 10 min.
5. Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione nuclei e incubare su ghiaccio per 10 min.
6. Centrifugare a 600 x g per 10 min scartare il supernatante.
7. Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione dei nuclei e centrifugare nuovamente. Scartare il supernatante. Il pellet finale sarà isolato nuclei.

7. estrazione di proteine

1. Ripetere la sezione 4, eccetto aggiungendo 25 μL del tampone di lisi 1x direttamente al pellet cellulare, quindi sospendendo.

8. preparazione del campione

1. Preparare due campioni per SDS-PAGE prendendo 10 μL ciascuno dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 μL di 2x Laemmli SDS-Sample buffer e 1 μL di 2-mercaptoetanolo (BME).
2. Riscaldare un campione per 5 min a 37 ° c e il secondo campione per 15 min a 98 ° c per invertire il collegamento a croce di formaldeide.

9. analisi SDS-PAGE

1. Preparare 1 L di 1x tampone di corsa tris-glicina (tris da 25 mM, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS).
2. Impostare l'apparecchiatura da corsa SDS-PAGE.
   Nota: questo protocollo utilizza un 16% prefabbricati SDS-page di TGX. Di nota, qualsiasi percentuale di gel può essere utilizzato.
   1. Per il protocollo del produttore, aprire la confezione in cui il gel è conservato e rimuovere la cassetta.
   2. Rimuovere il pettine che sta allineando i pozzi e il nastro dal fondo della cassetta.
   3. Collocare il gel nell'apparato di corsa.
   4. Riempire la camera con il tampone di corsa 1x fino a quando i pozzi sono sommersi in liquido. Utilizzando un Pipet di plastica, risciacquare i pozzetti con il tampone di corsa.
3. Caricare i campioni sul gel insieme a 10 μL di marcatore standard precolorato.
4. Eseguire il gel a 200 V fino a quando il colorante anteriore è di circa 1 cm dal fondo del gel.

10. Western blot

1. Preparare 1 L di tampone di trasferimento 1x (tris da 25 mM, 192 mM glicina, 20% metanolo) e conservare a 4 ° c fino all'uso.
2. Rimuovere con cautela il gel e aprire la cassetta. Utilizzando un rasoio, tagliare e scartare accuratamente il gel di impilamento. Raccogliere il gel utilizzando un angolo e posizionarlo in un vassoio con tampone di trasferimento, permettendo di Rock delicatamente per 5 min.
3. Mentre il gel è a dondolo, posizionare un blocco di ghiaccio (memorizzato in-20 ° c) nel serbatoio di trasferimento e aggiungere il buffer di trasferimento per 3/4 pieno.
4. Bagnare la membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) ammollo in 100% metanolo per 30 s.
5. Una volta che i 5 minuti sono passati, prepararsi a impostare il trasferimento in un vassoio con tampone di trasferimento. Il buffer di trasferimento deve essere sufficiente per immergere completamente la macchia. Impostare il trasferimento blot come segue: in basso, la parte inferiore del supporto della cassetta (nero); poi una spugna spessa, carta assorbente extra spessa, il gel di poliacrilammide, una membrana in PVDF, carta assorbente extra spessa e una spugna spessa; quindi infine la parte superiore del cassetto (bianco) in alto.
6. Bloccare la cassetta e posizionare l'unità nel serbatoio di trasferimento con la membrana in PVDF verso l'anodo positivo e il gel verso il negativo. Top off l'unità con tampone di trasferimento fino a quando il trasferimento è completamente sommerso.
7. Collocare l'unità sopra una piastra di agitazione. Aggiungere una barra di agitazione all'unità e iniziare a mescolare a 125 giri/min.
8. Correre a 100 V per 60 min.
9. Mentre il trasferimento è in funzione, preparare una soluzione di latte in polvere al 5% disciolto in soluzione salina tris-tamponata, con Tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Smontare l'unità e rimuovere la membrana, rilevando quale lato era in contatto con il gel; Assicurarsi che questo lato rimanga nel cassetto per i passaggi rimanenti.
11. Immergere la membrana per 2 minuti in soluzione salina con tamponata di tris (TBS) seguita bloccando la membrana incubando in 5 mL di 5% latte-TBST per 30 minuti a temperatura ambiente.
12. Sostituire il latte con un fresco 4 mL di 5% latte-TBST soluzione e aggiungere l'anticorpo primario alla diluizione corretta (in questo caso, la nostra diluizione è 1:2000 per l'anticorpo dUTPase) e incubare durante la notte con dolce dondolo a 4 ° c.
13. Il giorno seguente, rimuovere la macchia dal rocker 4 ° c a un rocker di temperatura ambiente, scartando la soluzione anticorpale primaria.
14. Fai tre Lavini rapidi con TBST, usando abbastanza liquido per immergere completamente la macchia, seguita da 3 Lavini, 5 min ciascuno, dondolando lentamente.
15. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 5 mL del 5% latte-TBST soluzione e roccia la macchia per 15 minuti poi scartare.
16. Aggiungere l'anticorpo secondario diluito in 5% latte-TBST alla concentrazione desiderata. (In questo caso, 1:5000 diluizione di capra anti-coniglio diluito in 5 mL di 5% latte-TBST soluzione)
17. Incubare a temperatura ambiente, dondolo per 1 h, quindi scartare la soluzione.
18. Fare tre lavaggi rapidi con TBST seguiti da 3 lavaggi, 5 min ciascuno, oscillare lentamente, poi scartare il lavaggio finale e aggiungere 5 mL di TBS.
19. Preparare una miscela 1:1 di una soluzione di rilevazione chemiluminescente ECL (1 mL di ogni reagente per un volume finale di 2 mL) e aggiungerlo direttamente alla macchia incubando per 1 min.
20. Rimuovere la membrana utilizzando le pinzette e tamponare l'angolo con un panno di laboratorio, rimuovendo qualsiasi soluzione in eccesso. Posizionare la membrana in involucro termoretraibile e posizionare il lato proteico in una cassetta radiografica.
21. Esporre la membrana alla pellicola a raggi x. Il tempo di esposizione varierà.

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Results

L'Dutpasi nucleare forma un legame disolfuro intermolecolare formando una configurazione di dimero stabile attraverso l'interazione di due residui di cisteina posizionati al terzo aminoacido di ogni proteina monomerica¹¹. Ciò è dimostrato in Figura 1a, B. Per garantire che questo legame disolfuro non fosse un'interazione non specifica a causa di anomalie migratorie nell'ambiente non ridotto, l'inclusione di un contro...

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Discussion

Il metodo qui delineato fornisce un protocollo diretto per l'analisi di complessi multimerici stabilizzati attraverso legami disolfuro. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre linee di coltura cellulare, tessuti e organismi che consentono una vasta gamma di applicazioni.

Un passo importante in questa procedura è quello di garantire che i legami disolfuro non sono una conseguenza della procedura di estrazione. Eventuali residui di cisteina liberi possono essere bloccati util...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090