18 mi lato Etichettatura F dei radiotracciati funzionalizzata con un accettatore di fluoruro di silicio (SiFA) per la tomografia a emissione di positroni

Riepilogo

La sintesi di fluoro-18 (¹⁸F) etichettato radiofarmaceutico per la tomografia a emissione di positroni richiede in genere mesi di esperienza. Quando incorporato in un radiotracciatore, il motivo SiFA (Silicon-fluorride acceptor) consente un semplice protocollo di ^{etichettatura F}di 18 che è indipendente da attrezzature costose e formazione preparatoria, riducendo la quantità precursore necessaria e utilizzando condizioni di reazione più lievi.

Abstract

Il motivo strutturale para-sostituito di-tert-butylfluorolbenzene noto come l'accettatore di silicio-fluoruro (SiFA) è un tag utile nel toolkit del radiochimico per incorporare il fluoruro radioattivo [¹⁸F]fluoruro nei traccianti per l'uso nella tomografia a emissione di positroni. Rispetto alle tradizionali strategie di radioetichettatura, lo scambio isotopico di fluoro-19 da SiFA con [¹⁸F]fluoruro viene effettuato a temperatura ambiente e richiede partecipanti alla reazione minima. La formazione di sottoprodotti è quindi trascurabile e la purificazione è notevolmente semplificata. Tuttavia, mentre la molecola precursore utilizzata per l'etichettatura e il prodotto radioetichettato finale sono isotopicamente discreti, sono chimicamente identici e sono quindi inseparabili durante le procedure di purificazione. Il tag SiFA è anche suscettibile alla degradazione nelle condizioni di base derivanti dalla lavorazione e dall'essiccazione di [¹⁸F]fluoruro. Il "metodo a 4 gocce", in cui solo le prime 4 gocce di eluito [¹⁸F]fluoruro vengono utilizzate dall'estrazione in fase solida, riduce la quantità di base nella reazione, facilita una minore quantità molare di precursore e riduce le degradazioni.

Introduzione

Fluoro-18 (109 minuti di emivita, 97% di emissione di positroni) è tra i più importanti radionuclidi per la tomografia a emissione di positroni (PET), un metodo di imaging non invasivo che visualizza e quantifica la bio-distribuzione dei traccianti radioetichettati per varie malattie¹. Peptidi e proteine sono particolarmente difficili da etichettare con [¹⁸F]fluoruro perché richiedono blocchi costitutivi formati da sintesi a più fasi². Per ridurre la complessità di ¹⁸F-radiolabeling, l'accettatore di fluoruro di silicio (SiFA) è stato recentemente introdotto come strumenti affidabili³. Il gruppo SiFA è costituito da un atomo di silicio centrale collegato a due gruppi di butile terziari, una moiety fenili derivata e un atomo fluoro non radioattivo. I gruppi terziari di butile conferiscono stabilità idrolitica al legame siliconico-fluoruro, che è una caratteristica fondamentale per le applicazioni in vivo di SiFA coniugati come agenti di imaging.

Quando sono attaccati a una piccola molecola o biomolecola, i blocchi costitutivi SiFA legano gli anioni radioattivi [¹⁸F]fluoruro scambiando fluoro-19 per fluoro-18 a concentrazioni di nanomolare senza formare quantità significative di prodotti laterali radioattivi⁴. Inoltre, un'elevata resa radiochimica si ottiene rapidamente etichettando la moiety SiFA in solventi aprotici dividuci a basse temperature. Questo è in netto contrasto con le reazioni di scambio isotopico classiche, che producono radiotracciatori di bassa attività specifica⁵. In questi casi, grandi quantità di precursori (nella gamma di milligrammi) devono essere utilizzati per ottenere una ragionevole incorporazione di [¹⁸F]fluoruro. Le reazioni di scambio isotopico con SiFA sono molto più efficienti, come confermato da studi cinetici e calcoli della teoria funzionale della densità^6,7. I SiFA etichettati sono facilmente purificati dall'estrazione in fase solida, poiché sia i composti SiFA etichettati che quelli non etichettati sono chimicamente identici. Questo differisce dai tradizionali traccianti radioetichettati, dove la molecola precursore e il prodotto etichettato sono due specie chimiche diverse e devono essere separati dopo la radioetichettatura da cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Utilizzando blocchi costitutivi SiFA, piccole molecole, proteine e peptidi possono essere etichettati con successo con [¹⁸F]fluoruro da protocolli di etichettatura in una e due fasi privi di complicate procedure di purificazione (Figura 1),⁴,^8,9. Inoltre, alcuni composti etichettati siFA sono affidabili agenti di imaging in vivo per il flusso sanguigno e tumori¹⁰. La semplicità della chimica SiFA consente anche ai ricercatori non addestrati di utilizzare [¹⁸F]fluoruro per la sintesi e lo sviluppo del radiotracciante.

Protocollo

AVVISO: Bisogna tenere a mente che ¹⁸F è un isotopo radioattivo, e quindi è necessario eseguire tutte le procedure alla base di un'adeguata schermatura. La schermatura del piombo è appropriata per questo tipo di radiazioni. Assicurarsi di indossare badge di rilevamento delle radiazioni per tutta la durata di questa procedura. Inoltre, smaltire immediatamente i guanti prima di toccare qualsiasi cosa dopo la sintesi, in quanto possono essere contaminati da attività radioattiva. Utilizzare monitor a piedi a mano e contatori Pancake Geiger per verificare la contaminazione di maniche, mani e piedi.

1. Essiccazione azeotropica di ¹⁸F-anion

NOTA: Figura 2A Mostra un grafico del flusso di lavoro di questa procedura, che richiede 10 min.

1. Precondizionare una cartuccia di cambio anion (QMA) diammoniaca quaternaria (QMA) passando per 0,5 M K₂CO₃ (10 mL) attraverso la cartuccia, seguita da acqua deionizzata (10 mL).
2. Passare una soluzione acquosa di [¹⁸F]F^-/[¹⁸O]H₂O (100-500 MBq) attraverso la cartuccia QMA precondizionata in retromarcia, utilizzando un adattatore da maschio a maschio. Eliminare il [¹⁸O]H₂O.
   NOTA: questi passaggi possono essere eseguiti utilizzando un modulo di sintesi automatico o utilizzando schermatura aggiuntiva sulla siringa.
3. Elutare le prime quattro gocce degli anioni fissi [¹⁸F]fluoroi dalla cartuccia QMA in una soluzione preparata di [2.2.2]cryptand (Table of Materials) (10 mg), 0.2 M 2 4_CO3 (50 L, 10 zmol) e acetonitrile (1 mL) in una v-vial densa mente-
   NOTA: Solo le prime quattro gocce vengono utilizzate come la maggior parte del radioattivo [¹⁸F]fluoruro è eluito fuori il QMA in queste gocce. Questo riduce la quantità di base portata avanti nella soluzione di magazzino^[18F]fluoruro, che è necessaria per evitare la degradazione della moiety SiFA.
4. Sigillare la fiala e posizionarla in un bagno di olio minerale di 90 gradi posizionato su una piastra calda. Inserire un ago di sfiato e un ago collegato a un flusso di gas argon nel setto del tappo della fiala. Attendere 5 min per far evaporare i solventi sotto il flusso dolce di argon. Rimuovere eventuali tracce rimanenti di acqua aggiungendo 1 mL di acetonitrile per facilitare la co-evaporazione azeotropica. Ripetere questo passaggio 2x per garantire la secchezza.
5. Una volta rimosso visibilmente il solvente, fermare il flusso di argon e rimuovere le siringhe dal tappo della fiala e rimuovere la fiala dal bagno d'olio.
6. Risospendere il fluoruro essiccato [¹⁸F]nel solvente di reazione di scelta.
   NOTA: In questo caso, acetonitrile (1 mL) viene aggiunto per creare una soluzione di stock altamente reattiva [¹⁸F^-]F^- (100-500 MBq). Questa soluzione può ora essere utilizzata per l'etichettatura.

2. Etichettatura SiFA-ligando in un unico passaggio

NOTA: Figura 2B mostra un grafico del flusso di lavoro di questa procedura, che richiede 15 min.

1. Precondizionare una cartuccia C-18 (Tabella dei materiali) risciacquandola con etanolo (10 mL) e acqua distillata (10 mL).
2. Aggiungete la soluzione di stock [¹⁸F^-]fluoruro a una fiala di reazione contenente un precursore con etichetta SiFA (100 nmol, 20-100 nmol). Lasciare che la reazione di etichettatura proceda per 5 min a temperatura ambiente senza agitare la soluzione.
   NOTA: L'intera soluzione di stock può essere aggiunta o un, a seconda di quanta attività si desidera per la reazione.
3. Prelevare la miscela di reazione in una siringa da 20 mL contenente tampone di fosfato da 0,1 M (9 mL) e passare la soluzione attraverso la cartuccia C-18 precondizionata per intrappolare il tracciante etichettato.
4. Lavare la cartuccia con acqua distillata (5 mL), quindi eluire il tracciante intrappolato dalla cartuccia C-18 con etanolo (300 - L) e diluire con cuscinetto fosfato sterile per l'iniezione (3 mL).
5. Passare il purificato [¹⁸F]SiFA-tracer attraverso un filtro sterile.
   NOTA: Per ottenere un PET chiaro immaginate per l'imaging di piccoli animali, la dose di circa il paziente diviso deve essere compresa tra 5-8 MBq. Per uso umano, la dose di paziente partizionato dovrebbe essere compresa tra 200,300 MBq.
6. Iniettare una piccola aliquota (4 MBq) del purificato [¹⁸F]SiFA-tracer su un sistema HPLC dotato di una colonna C-18 in fase invertita per confermare che la purezza radiochimica è superiore al 95%.

Risultati

Lo scambio isotopico SiFA semplicistico può raggiungere un elevato grado di incorporazione radiochimica di [¹⁸F]fluoruro (60-90%) con una quantità minima di complessità sintetica (Figura 1). La maggior parte delle molecole può essere radioetichettata con [¹⁸F]fluoruro in un unico passaggio senza coinvolgere HPLC per la purificazione (Figura 2). Radio-HPLC può essere utilizzato per scopi di controllo di qualità, in cui il picco di asso...

Discussione

La chimica dell'etichettatura SiFA rappresenta uno dei primi ¹⁸metodi di etichettatura F che impiegano una reazione di scambio isotopico straordinariamente efficiente che può essere eseguita a temperatura ambiente. Una tipica reazione radiochimica si basa sulla formazione di un legame carbonio-fluoro attraverso la reazione del^[18F]fluoruro con una funzionalità fluoruro-reattiva attraverso un percorso di eliminazione o sostituzione. Queste condizioni di reazione sono spesso dure, eseguite a pH estr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
[18F]F-/H2[18O]O	(Cyclotron produced)	-	-
[2.2.2]Cryptand	Aldrich	291110	Kryptofix 2.2.2
Acetonitrile anhydrous	Aldrich	271004	-
Deionized water	Baxter	JF7623	-
Ethanol, anhydrous	Commercial Alcohols		-
Potassium carbonate	Aldrich	209619	-
QMA cartridge	Waters	186004540	QMA SepPak Light (46 mg) cartridge
Equipment
C-18 cartridge	Waters	WAT023501	C-18 SepPak Light cartridge
C18 column	Phenomenex	00G-4041-N0	HPLC Luna C18 250 x 10 mm, 5 µm
HPLC	Agilent Technologies	-	HPLC 1200 series
micro-PET Scanner	Siemens	-	micro-PET R4 Scanner
Radio-TLC plate reader	Raytest	-	Radio-TLC Mini Gita
Sterile filter 0.22µm	Millipore	SLGP033RS	-